Proteomická analýza odhaluje aktivitu vrozené imunity při dysfunkci střevního transplantátu

ÚVOD:

Intestinální transplantace (ITx) představuje potenciální možnost přežití pro pacienty se střevním selháním, u kterých se vyvinuly život ohrožující komplikace. Celosvětově se ročně provádí přibližně 200 ITx výkonů, přičemž celkově bylo provedeno 2200 takových zákroků, z nichž dvě třetiny byly u dětí. Celkové přežití pacientů a štěpů se v posledních letech výrazně zlepšilo díky inovacím v chirurgických technikách, imunosupresi a pooperační péči. Jednoleté přežití pacientů se v zkušených centrech blíží 80-90 %. Nicméně akutní buněčné rejekce (ACR) stále představují pro tyto pacienty zásadní výzvy.

V současnosti je zlatým standardem pro diagnostiku ACR histologické vyšetření bioptických vzorků získaných během endoskopie. Mezi omezení patří skutečnost, že endoskopie je z definice invazivní, nákladná, spojená s riziky krvácení, infekce nebo perforace a potenciálně nepřesná. ACR se může projevovat jako ložiskový proces, který může být endoskopickým vyšetřením v až 30 % případů přehlédnut. Také se projevuje podobně jako infekce, což vede k diagnostickému dilematu ohledně optimálního managementu pacienta. Taková zpoždění a nepřesnosti v diagnostice a léčbě příjemců ITx mohou vést ke ztrátě pacienta nebo štěpu. Pro další rozvoj oboru ITx jsou zjevně zapotřebí nové neinvazivní techniky monitorování ACR.

Proteomika umožňuje identifikaci proteinů jako možných biomarkerů. Proteinové profily lze snadno detekovat v tělních tekutinách, což z těchto kombinací proteinů činí potenciálně inovativní biomarkery užitečné v diagnostice nebo monitorování onemocnění. Sledování hladin proteinů a metabolitů se může ukázat jako přesný screeningový nástroj pro pacienty s podezřením na ACR.

V této studii využíváme vysokokapacitní proteomickou analýzu a kandidátní imunodetekci proteinů ve výtoku ze stomie k neinvazivnímu hledání molekulárních profilů epiteliálního stresu a vrozené imunity během ACR.

IMUNOSUPRESE:

Všichni pacienti jsou léčeni trojitou imunosupresivní terapií založenou na takrolimu. Náš standardní imunosupresivní režim zahrnuje indukci antagonistou receptoru pro interleukin-2, jako je daklizumab nebo basiliximab, versus králičí antitymocytární globulin. Udržovací léčba sestává z takrolimu, kortikosteroidů a mykofenolát mofetilu. Cílové hladiny takrolimu v minimální koncentraci jsou 10-15 ng/mL. Sirolimus se používá jako záchranný prostředek a jako součást režimu šetřícího ledviny. ACR je diagnostikována histopatologicky a léčena vysokými dávkami steroidů. U pacientů s těžkou ACR se jako záchranný prostředek používá ATG. U vysoce senzibilizovaných pacientů nebo pacientů s podezřením na protilátkami zprostředkovanou rejekci se používá kombinace plazmaferézy, rituximabu a IVIG.

STŘEVNÍ SURVEILLANCE:

Protokolární biopsie transplantovaného střeva se získávají jednou týdně počínaje 7.-14. pooperačním dnem po dobu prvních 3-4 týdnů, poté jednou za 2 týdny až do 8 týdnů po ITx. Endoskopie a biopsie se také provádějí při klinických příznacích naznačujících abnormální funkci aloštěpu. Získává se více cílených biopsií a parafínem zalité řezy barvené hematoxylinem a eosinem (H&E) jsou hodnoceny na ACR pomocí standardních rejekčních kritérií jedním ze tří patologů UCLA specializujících se na gastrointestinální trakt. Abnormální výsledky vedou k další endoskopické surveillanci podle indikace.

ODBĚR VÝTOKU ZE STOMIE A PROTEOMICKÉ VYHODNOCENÍ:

Výtok ze stomie se odebírá, okamžitě se umístí na led a je hromadně zpracováván v laboratoři vysokokapacitní klinické proteomiky UCLA pro hmotnostní spektrometrii. Všechny vzorky jsou zpracovávány a analyzovány ve třech opakováních pomocí MALDI hmotnostní spektrometrie. MALDI-MS spektra se převádějí do textových souborů a předzpracovávají se pomocí zavedeného protokolu. Předzpracovaná MALDI data se poté exportují ze SpecAlign a dále analyzují v R.

ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY A IMUNOHISTOCHEMIE:

Lidský HNP 1-3 je kvantifikován ve zdvojených zpracovaných proteinových vzorcích pomocí ELISA soupravy podle pokynů výrobce (Cell Sciences, Canton, MA), s použitím standardní křivky HNP1-3 konstruované pro každou destičku. Koncentrace proteinů jsou také stanoveny pro každý testovaný vzorek (BCA, Pierce Thermo Scientific, Rockford, IL) a hladiny HNP1-3 jsou normalizovány na celkový protein (pg/mg).

Pro IHC jsou řezy z biopsií deparafinovány, blokovány na pozadí peroxidázové aktivity a vazby kozí protilátky standardními metodami a barveny lidskou protilátkou anti-HNP 1-3 (králičí, 1:2000) nebo předimunním sérem (králičí, 1:2000) jako negativní kontrola. Řezy se dále inkubují s biotinylovanou sekundární protilátkou anti-Králičí IgG a terciární protilátkou konjugovanou se streptavidin-peroxidázou ze sady Vectastain Elite ABC (Vector Laboratories) podle protokolu výrobce a vyvíjí se roztokem substrátu diaminobenzidin tetrahydrochloridu (DAB) (Pierce, Rockford, IL). Pro kvantifikaci IHC se u 10 krypt ve třech různých zorných polích na podložním sklíčku biopsie hodnotí přítomnost významného barvení defensinem. Počet defensin pozitivních krypt se počítá a průměruje.

LUMINEX:

Alikvot zpracovaného výtoku ze stomie se použije pro Luminex hodnocení pomocí Bio-Rad human cytokine 17-plex assay podle pokynů výrobce (Bio-Rad, Hercules, CA). Data se získávají na systému Bio-Plex 200 a analyzují se s příslušným softwarem (Bio-Rad) a koncentrace cytokinů jsou normalizovány na koncentraci proteinu a logaritmicky transformovány.