Proteomiikan analyysi paljastaa luontaisen immuniteetin aktiivisuuden suolensiirtohäiriössä

JOHDANTO:

Suolensiirto (ITx) tarjoaa mahdollisen eloonjäämiskeinon suolistovajaatoiminnasta kärsiville potilaille, joilla on kehittynyt hengenvaarallisia komplikaatioita. Maailmanlaajuisesti suoritetaan vuosittain noin 200 ITx-toimenpidettä, ja yhteensä tällaisia toimenpiteitä on tehty 2200, joista kaksi kolmasosaa on tehty lapsille. Potilaan ja siirrekeen eloonjäämisasteet ovat parantuneet merkittävästi viime vuosina kirurgisten tekniikoiden, immunosupression ja siirron jälkeisen hoidon innovaatioiden ansiosta. Kokeneissa keskuksissa yhden vuoden potilaan eloonjäämisasteet lähestyvät 80–90 prosenttia. Siitä huolimatta akuutti soluistunto (ACR) aiheuttaa edelleen merkittäviä haasteita näille potilaille.

Tällä hetkellä ACR:n diagnosoinnin kultainen standardi on endoskopian aikana otettujen biopsianäytteiden histologinen tutkimus. Rajoituksiin kuuluu se, että endoskopia on määritelmänsä mukaan invasiivinen, kallis, liittyy verenvuodon, infektion tai perforaation riskeihin ja on mahdollisesti epätarkka. ACR voi esiintyä laikullisena prosessina, joka endoskooppisen seurannan aikana voi jäädä huomaamatta jopa 30 prosentissa tapauksista. Se myös esiintyy samankaltaisesti kuin infektio, mikä johtaa diagnostiseen dilemmaan potilaan optimaalisen hoidon suhteen. Tällaiset viiveet ja epätarkkuudet ITx-potilaiden diagnosoinnissa ja hoidossa voivat johtaa potilaan ja siirrekeen menetykseen. Uusia ei-invasiivisia tekniikoita ACR:n seurantaan tarvitaan selvästi, jotta ITx-alan kehitys voi jatkua eteenpäin.

Proteomiikka mahdollistaa proteiinien tunnistamisen mahdollisina biomarkkereina. Profiinit voidaan helposti havaita kehon nesteissä, mikä tekee näistä proteiinien yhdistelmistä mahdollisesti innovatiivisia biomarkkereita, joita voidaan hyödyntää diagnosoinnissa tai sairauden seurannassa. Proteiinien ja metaboliittien tasojen seuraaminen voi osoittautua tarkaksi seulontatyökaluksi potilaille, joilla epäillään olevan ACR.

Tässä tutkimuksessa käytämme suorituskykyistä proteomiikka-analyysiä ja kandidaatti-immunoassay-proteiinien havaitsemista stomapohjaisista eritteistä etsimään ei-invasiivisella tavalla epiteliaalisen stressin ja synnynnäisen immuniteetin molekyyliprofiileja ACR:n aikana.

IMMUNOSUPPRESSIO:

Kaikkia potilaita hoidetaan takrolimuuspohjaisella kolmoisimmunosupressiolla. Standardimme immunosupressiohoito sisältää induktion interleukiini-2-reseptoriantagonistilla, kuten daklitsumabilla tai basiliksimabilla, tai kaniinin antitymosyyttiglobuliinilla. Ylläpitohoito koostuu takrolimuksesta, kortikosteroideista ja mykofenolaattimofetiilistä. Kohdetakrolimuksen pohjataso on 10–15 ng/ml. Sirolimuusta käytetään pelastuslääkkeenä ja osana munuaissäästävää hoitosuunnitelmaa. ACR diagnosoidaan histopatologisesti ja hoidetaan suurilla steroidiannoksilla. Potilailla, joilla on vakava ACR, käytetään ATG:tä pelastuslääkkeenä. Erittäin herkistyneillä potilailla tai potilailla, joilla epäillään vastaainevälitteistä hyljintää, käytetään yhdistelmää plasmanvaihto, Rituksimabi ja IVIG.

SUOLISTON SEURANTA:

Protokollabiopsiat siirretystä suolistosta otetaan kerran viikossa alkaen leikkauksen jälkeiseltä päivältä 7–14 ensimmäisten 3–4 viikon ajan, sitten kerran kahdessa viikossa kunnes 8 viikkoa ITx:n jälkeen. Endoskopiaa ja biopsioita otetaan myös kliinisten oireiden perusteella, jotka osoittavat epänormaalia siirrekeen toimintaa. Otetaan useita kohdennettuja biopsioita, ja parafiiniin upotetut leikkeet värjätään hematoksyliinilla ja eosiinilla (H&E) ja luokitellaan ACR:lle käyttäen standardihylkintäkriteerejä yhden kolmen UCLA:n gastroenterologisen patologin toimesta. Epänormaalit tulokset edellyttävät lisää endoskooppista seurantaa tarpeen mukaan.

STOMAPOHJAISTEN ERITTEIDEN KERÄÄMINEN JA PROTEOMINEN ARVIOINTI:

Stomapohjaiset eritteet kerätään, asetetaan välittömästi jäälle ja käsitellään erissä UCLA:n suorituskykyisessä kliinisessä proteomiikan massaspektrometrialaboratoriossa. Kaikki näytteet käsitellään ja analysoidaan kolminkertaisesti käyttäen MALDI-massaspektrometriaa. MALDI-MS-spektrit muunnetaan tekstitiedostoiksi ja esikäsitellään vakiintuneella protokollalla. Esikäsitelty MALDI-data viedään sitten SpecAlignista ja analysoidaan edelleen R:ssä.

ENTSYYMILINKITTY IMMUNOSORBENTTITESTI JA IMMUNOHISTOKEMIA:

Ihmisen HNP 1-3 määritetään kahdesti käsitellyissä proteiininäytteissä ELISA-kitillä valmistajan ohjeiden mukaisesti (Cell Sciences, Canton, MA), käyttäen HNP1-3-standardikäyrää, joka rakennetaan jokaiselle levylle. Proteiinipitoisuudet määritetään myös jokaiselle testinäytteelle (BCA, Pierce Thermo Scientific, Rockford, IL), ja HNP1-3-tasot normalisoidaan kokonaisproteiiniin (pg/mg).

IHC:lle biopsialeikkeet deparaffinoidaan, estetään taustaperoksidaasiaktiivisuus ja vuohen vastaaineiden sitoutuminen standardimenetelmillä, ja värjätään ihmisen anti-HNP 1-3 -vastaaineella (kaniini, 1:2000) tai ennen immunisaatiota otetulla seerumilla (kaniini, 1:2000) negatiivisena kontrollina. Leikkeet inkuboidaan edelleen anti-Kaniini IgG-biotinyloitu sekundäärivastaaineella ja streptavidini-peroksidaasiin konjugoidulla tertiäärisellä vastaaineella Vectastain Elite ABC -kitsistä (Vector Laboratories) valmistajan protokollan mukaisesti, ja kehitetään diaminobentsidiinitetrahydrokloridi (DAB) -substraattiliuoksella (Pierce, Rockford, IL). IHC-kvantifiointia varten 10 kryptaa kolmella eri kentällä biopsialiuskalla arvioidaan merkittävän defensiinivärjäyksen perusteella. Defensiinipositiivisten kryptojen määrä lasketaan ja keskiarvoistetaan.

LUMINEX:

Osa käsitellystä stomapohjaisesta eritteestä käytetään Luminex-arviointiin Bio-Rad ihmisen sytokiini 17-plex -testillä valmistajan ohjeiden mukaisesti (Bio-Rad, Hercules, CA). Data kerätään Bio-Plex 200 -järjestelmällä ja analysoidaan siihen liittyvällä ohjelmistolla (Bio-Rad), ja sytokiinipitoisuudet normalisoidaan proteiinipitoisuuteen ja logaritmisesti muunnetaan.