Протеомный анализ выявляет активность врожденного иммунитета при дисфункции кишечного трансплантата

ВВЕДЕНИЕ:

Трансплантация кишечника (ТК) представляет собой потенциальный метод выживания для пациентов с кишечной недостаточностью, у которых развились угрожающие жизни осложнения. Ежегодно в мире выполняется приблизительно 200 процедур ТК, всего было выполнено 2200 таких процедур, две трети из которых — у детей. В целом, показатели выживаемости пациентов и трансплантатов значительно улучшились за последние несколько лет благодаря инновациям в хирургических методиках, иммуносупрессии и посттрансплантационном ведении. Показатели однолетней выживаемости пациентов достигают 80-90% в опытных центрах. Тем не менее, острое клеточное отторжение (ОКО) продолжает представлять серьезные проблемы у этих пациентов.

В настоящее время золотым стандартом диагностики ОКО является гистологическое исследование биопсийных образцов, полученных во время эндоскопии. Ограничения включают тот факт, что эндоскопия по определению является инвазивной, дорогостоящей, связана с рисками кровотечения, инфекции или перфорации и потенциально неточной. ОКО может проявляться как очаговый процесс, который может быть пропущен при эндоскопическом наблюдении вплоть до 30% случаев. Оно также проявляется аналогично инфекции, что приводит к диагностической дилемме относительно оптимального ведения пациента. Такие задержки и неточности в диагностике и ведении реципиентов ТК потенциально могут привести к потере пациента и трансплантата. Для дальнейшего развития области ТК явно необходимы новые неинвазивные методы мониторинга ОКО.

Протеомика позволяет идентифицировать белки в качестве возможных биомаркеров. Профили белков можно легко обнаружить в жидкостях организма, что делает эти комбинации белков потенциально инновационными биомаркерами, полезными в диагностике или мониторинге заболевания. Отслеживание уровней белков и метаболитов может оказаться точным скрининговым инструментом для пациентов с подозрением на ОКО.

В данном исследовании мы используем высокопроизводительный протеомный анализ и кандидатный иммуноферментный анализ белков в стомных эффлюентах для неинвазивного поиска молекулярных профилей эпителиального стресса и врожденного иммунитета во время ОКО.

ИММУНОСУПРЕССИЯ:

Все пациенты получают тройную иммуносупрессию на основе такролимуса. Наша стандартная схема иммуносупрессии включает индукцию антагонистом рецептора интерлейкина-2, таким как даклизумаб или базиликсимаб, в сравнении с кроличьим антитимоцитарным глобулином. Поддерживающая терапия состоит из такролимуса, кортикостероидов и микофенолата мофетила. Целевые уровни такролимуса в плазме составляют 10-15 нг/мл. Сиролимус используется в качестве спасательного агента и как часть почечно-щадящего режима. ОКО диагностируется гистопатологически и лечится высокими дозами стероидов. У пациентов с тяжелым ОКО в качестве спасательного агента используется АТГ. У высокосенсибилизированных пациентов или пациентов с подозрением на антител-опосредованное отторжение используется комбинация плазмафереза, ритуксимаба и ВВИГ.

НАБЛЮДЕНИЕ ЗА КИШЕЧНИКОМ:

Протокольные биопсии трансплантированного кишечника берутся один раз в неделю, начиная с 7-14 послеоперационного дня, в течение первых 3-4 недель, затем один раз в две недели до 8 недель после ТК. Эндоскопия и биопсии также проводятся при клинических симптомах, указывающих на ненормальную функцию аллотрансплантата. Получаются множественные целевые биопсии, и парафиновые срезы, окрашенные гематоксилином и эозином (H&E), оцениваются на предмет ОКО с использованием стандартных критериев отторжения одним из трех гастроинтестинальных патологов Калифорнийского университета в Лос-Анджелесе (UCLA). Аномальные результаты требуют дальнейшего эндоскопического наблюдения по показаниям.

СБОР СТОМНЫХ ЭФФЛЮЕНТОВ И ПРОТЕОМНАЯ ОЦЕНКА:

Стомные эффлюенты собираются, немедленно помещаются на лед и обрабатываются партиями в основной лаборатории масс-спектрометрии высокопроизводительной клинической протеомики UCLA. Все образцы обрабатываются и анализируются в трехкратной повторности с использованием масс-спектрометрии MALDI. Спектры MALDI-MS преобразуются в текстовые файлы и предварительно обрабатываются по установленному протоколу. Предварительно обработанные данные MALDI затем экспортируются из SpecAlign и далее анализируются в R.

ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ И ИММУНОГИСТОХИМИЯ:

Человеческий HNP 1-3 количественно определяется в дублированных обработанных белковых образцах с помощью набора ELISA в соответствии с инструкциями производителя (Cell Sciences, Кантон, Массачусетс), с использованием калибровочной кривой HNP1-3, построенной для каждой планшеты. Концентрации белка также определяются для каждого тестового образца (BCA, Pierce Thermo Scientific, Рокфорд, Иллинойс), и уровни HNP1-3 нормализуются к общему белку (пг/мг).

Для ИГХ срезы биопсии депарафинизируются, блокируются на фоновую пероксидазную активность и связывание козьих антител стандартными методами, и окрашиваются человеческим анти-HNP 1-3 антителом (кроличьим, 1:2000) или предварительно иммунизированной сывороткой (кроличьей, 1:2000) в качестве отрицательного контроля. Срезы далее инкубируются с биотинилированным вторичным антителом против кроличьего IgG и стрептавидин-пероксидазным конъюгированным третичным антителом из набора Vectastain Elite ABC (Vector Laboratories) в соответствии с протоколом производителя, и проявляются раствором субстрата диамино-бензидин тетрагидрохлорида (DAB) (Pierce, Рокфорд, Иллинойс). Для количественной оценки ИГХ 10 крипт в трех разных полях на слайде биопсии оцениваются на предмет значительного окрашивания дефенсином. Количество дефенсин-положительных крипт подсчитывается и усредняется.

LUMINEX:

Аликвота обработанного стомного эффлюента используется для оценки Luminex с помощью анализа Bio-Rad human cytokine 17-plex в соответствии с инструкциями производителя (Bio-Rad, Геркулес, Калифорния). Данные получаются на системе Bio-Plex 200 и анализируются с помощью соответствующего программного обеспечения (Bio-Rad), а концентрации цитокинов нормализуются к концентрации белка и логарифмически преобразуются.