L'Analisi Proteomica Rivela Attività Immunitaria Innata nella Disfunzione del Trapianto Intestinale

INTRODUZIONE:

Il trapianto intestinale (ITx) offre un potenziale mezzo di sopravvivenza per i pazienti con insufficienza intestinale che hanno sviluppato complicazioni potenzialmente letali. Circa 200 procedure di ITx vengono eseguite ogni anno in tutto il mondo, con un totale di 2200 procedure eseguite, due terzi delle quali riguardano bambini. In generale, i tassi di sopravvivenza del paziente e dell'innesto sono migliorati significativamente negli ultimi anni grazie alle innovazioni nelle tecniche chirurgiche, nell'immunosoppressione e nella gestione post-trapianto. I tassi di sopravvivenza del paziente a un anno si avvicinano all'80-90% nei centri esperti. Tuttavia, il rigetto cellulare acuto (ACR) continua a rappresentare una sfida importante in questi pazienti.

Attualmente, il gold standard per la diagnosi dell'ACR è l'esame istologico dei campioni di biopsia ottenuti al momento dell'endoscopia. Le limitazioni includono il fatto che l'endoscopia è per definizione invasiva, costosa, associata a rischi di sanguinamento, infezione o perforazione e potenzialmente inaccurata. L'ACR può presentarsi come un processo a chiazze che potrebbe essere perso dalla sorveglianza endoscopica fino al 30% delle volte. Si presenta anche in modo simile a un'infezione, portando a un dilemma diagnostico sulla gestione ottimale del paziente. Tali ritardi e inesattezze nella diagnosi e nella gestione dei riceventi di ITx hanno il potenziale di portare alla perdita del paziente e dell'innesto. Nuove tecniche non invasive per monitorare l'ACR sono chiaramente necessarie per continuare a far progredire il campo dell'ITx.

La proteomica consente l'identificazione di proteine come possibili biomarcatori. I profili proteici possono essere facilmente rilevati nei fluidi corporei, rendendo queste combinazioni proteiche potenzialmente biomarcatori innovativi utili nella diagnosi o nel monitoraggio delle malattie. Il monitoraggio dei livelli di proteine e metaboliti potrebbe rivelarsi uno strumento di screening accurato per i pazienti sospettati di avere ACR.

In questo studio, utilizziamo l'analisi proteomica ad alto rendimento e il rilevamento proteico immunoenzimatico dei candidati degli effluenti di stomia per cercare in modo non invasivo profili molecolari di stress epiteliale e immunità innata durante l'ACR.

IMMUNOSOPPRESSIONE:

Tutti i pazienti sono gestiti con una tripla immunosoppressione basata su tacrolimus. Il nostro regime standard di immunosoppressione include l'induzione con un antagonista del recettore dell'interleuchina-2 come daclizumab o basiliximab, rispetto alla globulina antitimocita di coniglio. La terapia di mantenimento consiste in tacrolimus, corticosteroidi e micofenolato mofetile. I livelli target di tacrolimus sono 10-15 ng/mL. Il sirolimus viene utilizzato come agente di salvataggio e come parte di un regime risparmiatore renale. L'ACR viene diagnosticato dall'istopatologia e trattato con steroidi ad alte dosi. Nei pazienti con ACR grave, l'ATG viene utilizzato come agente di salvataggio. Nei pazienti altamente sensibilizzati o sospettati di rigetto mediato da anticorpi, viene utilizzata una combinazione di plasmaferesi, Rituximab e IVIG.

SORVEGLIANZA INTESTINALE:

Le biopsie protocollari dell'intestino trapiantato vengono ottenute una volta alla settimana a partire dal giorno postoperatorio 7-14 per le prime 3-4 settimane, poi una volta ogni 2 settimane fino a 8 settimane dopo l'ITx. L'endoscopia e le biopsie vengono anche ottenute per sintomi clinici che indicano una funzione anomala dell'allotrapianto. Vengono ottenute biopsie mirate multiple e sezioni incluse in paraffina colorate con ematossilina e eosina (H&E) vengono classificate per ACR utilizzando criteri standard di rigetto da uno dei tre patologi gastrointestinali dell'UCLA. I risultati anomali richiedono ulteriore sorveglianza endoscopica come indicato.

RACCOLTA DEGLI EFFLUENTI DI STOMIA E VALUTAZIONE PROTEOMICA:

Gli effluenti di stomia vengono raccolti, immediatamente posti su ghiaccio e processati in batch presso il laboratorio centrale di spettrometria di massa di proteomica clinica ad alto rendimento dell'UCLA. Tutti i campioni vengono processati e analizzati in triplicato utilizzando la spettrometria di massa MALDI. Gli spettri MALDI-MS vengono convertiti in file di testo e preprocessati utilizzando un protocollo stabilito. I dati MALDI preprocessati vengono quindi esportati da SpecAlign e ulteriormente analizzati in R.

SAGGIO DI IMMUNOASSORBIMENTO LEGATO AD ENZIMA E IMMUNOISTOCHIMICA:

L'HNP 1-3 umano viene quantificato in duplicato nei campioni proteici processati da un kit ELISA seguendo le istruzioni del produttore (Cell Sciences, Canton, MA), utilizzando una curva standard HNP1-3 costruita per ogni piastra. Le concentrazioni proteiche sono anche determinate per ogni campione di test (BCA, Pierce Thermo Scientific, Rockford, IL) e i livelli di HNP1-3 normalizzati alla proteina totale (pg/mg).

Per l'IHC, le sezioni di biopsia vengono deparaffinate, bloccate per l'attività perossidasi di fondo e il legame dell'anticorpo di capra con metodi standard e colorate con anticorpo anti-HNP 1-3 umano (coniglio, 1:2000) o siero preimmunizzato (coniglio, 1:2000) come controllo negativo. Le sezioni vengono ulteriormente incubate con un anticorpo secondario biotinilato anti-IgG di coniglio e un anticorpo terziario coniugato con streptavidina-perossidasi dal kit Vectastain Elite ABC (Vector Laboratories) secondo il protocollo del produttore e sviluppate con soluzione substrato di diaminobenzidina tetraidrocloruro (DAB) (Pierce, Rockford, IL). Per la quantificazione IHC, 10 cripte in tre campi diversi sul vetrino della biopsia vengono valutate per evidenza di colorazione significativa della defensina. Il numero di cripte positive alla defensina viene contato e mediato.

LUMINEX:

Un'aliquota di effluente di stomia processato viene utilizzata per la valutazione Luminex, con il saggio Bio-Rad human cytokine 17-plex secondo le istruzioni del produttore (Bio-Rad, Hercules, CA). I dati vengono acquisiti su un sistema Bio-Plex 200 e analizzati con il software associato (Bio-Rad) e le concentrazioni di citochine vengono normalizzate alla concentrazione proteica e trasformate in logaritmo.