Analiza proteomiczna ujawnia aktywność odporności wrodzonej w dysfunkcji przeszczepu jelitowego

WPROWADZENIE:

Przeszczepienie jelita (ITx) stanowi potencjalną metodę przeżycia dla pacjentów z niewydolnością jelitową, u których rozwinęły się zagrażające życiu powikłania.
Na całym świecie rocznie wykonuje się około 200 procedur ITx, a łącznie przeprowadzono 2200 takich procedur, z czego dwie trzecie u dzieci.
Ogólne wskaźniki przeżycia pacjentów i przeszczepów uległy znaczącej poprawie w ciągu ostatnich kilku lat dzięki innowacjom w technikach chirurgicznych, immunosupresji i postępowaniu po przeszczepie.
Roczne wskaźniki przeżycia pacjentów zbliżają się do 80-90% w doświadczonych ośrodkach.
Niemniej jednak, ostre odrzucenie komórkowe (ACR) nadal stanowi poważne wyzwanie u tych pacjentów.

Obecnie złotym standardem w diagnostyce ACR jest badanie histologiczne próbek pobranych podczas endoskopii.
Ograniczenia obejmują fakt, że endoskopia jest z definicji inwazyjna, kosztowna, wiąże się z ryzykiem krwawienia, infekcji lub perforacji oraz może być niedokładna.
ACR może mieć charakter ogniskowy, co może zostać przeoczone podczas nadzoru endoskopowego nawet w 30% przypadków.
Objawia się również w podobny sposób jak infekcja, prowadząc do dylematu diagnostycznego dotyczącego optymalnego postępowania z pacjentem.
Takie opóźnienia i nieścisłości w diagnostyce i leczeniu biorców ITx mogą prowadzić do utraty pacjenta lub przeszczepu.
Nowe nieinwazyjne techniki monitorowania ACR są wyraźnie potrzebne, aby nadal rozwijać dziedzinę ITx.

Proteomika umożliwia identyfikację białek jako potencjalnych biomarkerów.
Profile białkowe można łatwo wykryć w płynach ustrojowych, co czyni te kombinacje białek potencjalnie innowacyjnymi biomarkerami przydatnymi w diagnostyce lub monitorowaniu choroby.
Monitorowanie poziomów białek i metabolitów może okazać się dokładnym narzędziem przesiewowym u pacjentów z podejrzeniem ACR.

W tym badaniu wykorzystujemy wysokoprzepustową analizę proteomiczną i wykrywanie białek metodą immunoassay w płynach ze stomii, aby w sposób nieinwazyjny poszukiwać profili molekularnych stresu nabłonkowego i odporności wrodzonej podczas ACR.

IMMUNOSUPRESJA:

Wszyscy pacjenci są leczeni trójskładnikową immunosupresją opartą na takrolimusie.
Nasz standardowy schemat immunosupresji obejmuje indukcję za pomocą antagonisty receptora interleukiny-2, takiego jak daklizumab lub bazyliksymab, lub globuliny antytymocytarnej króliczej.
Leczenie podtrzymujące składa się z takrolimusu, kortykosteroidów i mykofenolanu mofetylu.
Docelowe stężenia takrolimusu w osoczu wynoszą 10-15 ng/mL.
Sirolimus jest stosowany jako lek ratunkowy oraz jako część schematu oszczędzającego nerki.
ACR jest diagnozowane za pomocą histopatologii i leczone wysokimi dawkami steroidów.
U pacjentów z ciężkim ACR, ATG jest stosowany jako lek ratunkowy.
U pacjentów wysoko uczulonych lub z podejrzeniem odrzucenia zależnego od przeciwciał stosuje się kombinację plazmaferezy, rytuksymabu i IVIG.

NADZÓR JELITOWY:

Biopsje protokołowe przeszczepionego jelita są pobierane raz w tygodniu, począwszy od 7-14 dnia pooperacyjnego przez pierwsze 3-4 tygodnie, następnie co 2 tygodnie do 8 tygodni po ITx.
Endoskopia i biopsje są również wykonywane w przypadku objawów klinicznych wskazujących na nieprawidłową funkcję alloprzeszczepu.
Pobiera się wiele celowanych biopsji, a sekcje zatopione w parafinie barwione hematoksyliną i eozyną (H&E) są oceniane pod kątem ACR przy użyciu standardowych kryteriów odrzucenia przez jednego z trzech patologów przewodu pokarmowego UCLA.
Nieprawidłowe wyniki skłaniają do dalszego nadzoru endoskopowego, zgodnie ze wskazaniami.

POBIERANIE PŁYNÓW ZE STOMII I OCENA PROTEOMICZNA:

Płyny ze stomii są zbierane, natychmiast umieszczane na lodzie i przetwarzane partiami w laboratorium spektrometrii mas UCLA High Throughput Clinical Proteomics.
Wszystkie próbki są przetwarzane i analizowane w trzykrotnych powtórzeniach przy użyciu spektrometrii mas MALDI.
Widma MALDI-MS są konwertowane do plików tekstowych i wstępnie przetwarzane przy użyciu ustalonego protokołu.
Wstępnie przetworzone dane MALDI są następnie eksportowane z SpecAlign i dalej analizowane w R.

TEST IMMUNOSORPCYJNY ZWIĄZANY Z ENZYMEM I IMMUNOHISTOCHEMIA:

Ludzkie HNP 1-3 są oznaczane w duplikatach przetworzonych próbek białkowych za pomocą zestawu ELISA zgodnie z instrukcją producenta (Cell Sciences, Canton, MA), przy użyciu krzywej standardowej HNP1-3 skonstruowanej dla każdej płytki.
Stężenia białek są również określane dla każdej próbki testowej (BCA, Pierce Thermo Scientific, Rockford, IL), a poziomy HNP1-3 są normalizowane do całkowitego białka (pg/mg).

W przypadku IHC, skrawki biopsji są odparafinowywane, blokowane pod kątem aktywności peroksydazy tła i wiązania przeciwciał kozich metodami standardowymi oraz barwione przeciwciałem anty-HNP 1-3 ludzkim (królik, 1:2000) lub surowicą przedimmunizacyjną (królik, 1:2000) jako kontrola negatywna.
Skrawki są następnie inkubowane z biotynylowanym przeciwciałem wtórnym anty-króliczym IgG oraz sprzężonym z peroksydazą streptawidyny przeciwciałem trzeciorzędowym z zestawu Vectastain Elite ABC (Vector Laboratories) zgodnie z protokołem producenta i rozwinięte za pomocą roztworu substratu diaminobenzydyny tetrahydrochloridu (DAB) (Pierce, Rockford, IL).
Do ilościowej oceny IHC, 10 krypt w trzech różnych polach na szkiełku biopsyjnym jest ocenianych pod kątem istotnego barwienia defensyn.
Liczba krypt dodatnich pod względem defensyn jest liczona i uśredniana.

LUMINEX:

Alikwot przetworzonego płynu ze stomii jest wykorzystywany do oceny Luminex, z testem Bio-Rad human cytokine 17-plex zgodnie z instrukcją producenta (Bio-Rad, Hercules, CA).
Dane są pozyskiwane na systemie Bio-Plex 200 i analizowane za pomocą powiązanego oprogramowania (Bio-Rad), a stężenia cytokin są normalizowane do stężenia białka i poddane transformacji logarytmicznej.