Análise Proteómica Revela Atividade Imunitária Inata na Disfunção de Transplante Intestinal

INTRODUÇÃO:

O transplante intestinal (TI) oferece um meio potencial de sobrevivência para doentes com insuficiência intestinal que desenvolveram complicações com risco de vida. Aproximadamente 200 procedimentos de TI são realizados em todo o mundo por ano, tendo sido realizados no total 2200 desses procedimentos, dois terços dos quais em crianças. No geral, as taxas de sobrevivência do doente e do enxerto melhoraram significativamente nos últimos anos devido a inovações em técnicas cirúrgicas, imunossupressão e gestão pós-transplante. As taxas de sobrevivência do doente a um ano aproximam-se de 80-90% em centros experientes. No entanto, a rejeição celular aguda (RCA) continua a representar grandes desafios nestes doentes.

Atualmente, o padrão de ouro para o diagnóstico de RCA é o exame histológico de amostras de biópsia obtidas no momento da endoscopia. As limitações incluem o facto de a endoscopia ser, por definição, invasiva, dispendiosa, associada a riscos de hemorragia, infeção ou perfuração, e potencialmente imprecisa. A RCA pode apresentar-se como um processo irregular que pode ser perdido pela vigilância endoscópica até 30% das vezes. Também se apresenta de forma semelhante à infeção, levando a um dilema diagnóstico quanto à gestão ideal do doente. Tais atrasos e imprecisões no diagnóstico e gestão de recipientes de TI têm o potencial de levar à perda do doente e do enxerto. São claramente necessárias novas técnicas não invasivas para monitorizar a RCA para continuar a impulsionar o campo do TI.

A proteómica permite a identificação de proteínas como possíveis biomarcadores. Os perfis proteicos podem ser facilmente detetados em fluidos corporais, tornando estas combinações proteicas biomarcadores potencialmente inovadores úteis no diagnóstico ou monitorização da doença. A monitorização dos níveis de proteínas e metabolitos pode revelar-se uma ferramenta de rastreio precisa para doentes suspeitos de ter RCA.

Neste estudo, usamos análise proteómica de alto rendimento e deteção proteica por imunoensaio candidato de efluentes de ostomia para procurar, de forma não invasiva, perfis moleculares de stress epitelial e imunidade inata durante a RCA.

IMUNOSSUPRESSÃO:

Todos os doentes são tratados com imunossupressão tripla baseada em tacrolimus. O nosso regime padrão de imunossupressão inclui indução com um antagonista do recetor de interleucina-2, como daclizumab ou basiliximab, versus globulina antitimócita de coelho. A terapia de manutenção consiste em tacrolimus, corticosteroides e micofenolato mofetil. Os níveis alvo de tacrolimus em vale são 10-15 ng/mL. O sirolimus é usado como agente de resgate e como parte de um regime poupador renal. A RCA é diagnosticada por histopatologia e tratada com esteroides em alta dose. Em doentes com RCA grave, a ATG é usada como agente de resgate. Em doentes altamente sensibilizados ou suspeitos de rejeição mediada por anticorpos, é usada uma combinação de plasmaferese, Rituximab e IVIG.

VIGILÂNCIA INTESTINAL:

Biópsias de protocolo do intestino transplantado são obtidas uma vez por semana a partir do dia 7-14 pós-operatório durante as primeiras 3-4 semanas, depois uma vez a cada 2 semanas até 8 semanas após o TI. A endoscopia e biópsias também são obtidas para sintomas clínicos indicativos de função anormal do aloenxerto. São obtidas múltiplas biópsias direcionadas, e secções embebidas em parafina coradas com hematoxilina e eosina (H&E) são classificadas para RCA usando critérios padrão de rejeição por um dos três patologistas gastrointestinais da UCLA. Resultados anormais levam a uma vigilância endoscópica adicional conforme indicado.

COLETA DE EFLUENTE DE OSTOMIA E AVALIAÇÃO PROTEÓMICA:

Os efluentes de ostomia são recolhidos, imediatamente colocados no gelo e processados em lote no laboratório central de espectrometria de massa de Proteómica Clínica de Alto Rendimento da UCLA. Todas as amostras são processadas e analisadas em triplicado usando espectrometria de massa MALDI. Os espectros MALDI-MS são convertidos em ficheiros de texto e pré-processados usando um protocolo estabelecido. Os dados MALDI pré-processados são então exportados do SpecAlign e analisados posteriormente em R.

ENSAIO DE IMUNOABSORÇÃO ENZIMÁTICA E IMUNOHISTOQUÍMICA:

O HNP 1-3 humano é quantificado em duplicado em amostras de proteína processadas por um kit ELISA seguindo as instruções do fabricante (Cell Sciences, Canton, MA), usando uma curva padrão de HNP1-3 construída para cada placa. As concentrações de proteína também são determinadas para cada amostra de teste (BCA, Pierce Thermo Scientific, Rockford, IL), e os níveis de HNP1-3 normalizados para proteína total (pg/mg).

Para IHC, as secções de biópsia são desparafinadas, bloqueadas para atividade de peroxidase de fundo e ligação de anticorpo de cabra por métodos padrão, e coradas com anticorpo anti-HNP 1-3 humano (coelho, 1:2000) ou soro pré-imunizado (coelho, 1:2000) como controlo negativo. As secções são ainda incubadas com um anticorpo secundário biotinilado anti-IgG de Coelho e um anticorpo terciário conjugado com estreptavidina-peroxidase do kit Vectastain Elite ABC (Vector Laboratories) de acordo com o protocolo do fabricante, e desenvolvidas por solução de substrato de diaminobenzidina tetrahidrocloreto (DAB) (Pierce, Rockford, IL). Para quantificação de IHC, 10 criptas em três campos diferentes na lâmina de biópsia são avaliadas quanto a evidência de coloração significativa de defensina. O número de criptas positivas para defensina é contado e calculada a média.

LUMINEX:

Uma alíquota de efluente de ostomia processado é usada para avaliação Luminex, com o ensaio Bio-Rad human cytokine 17-plex de acordo com as instruções do fabricante (Bio-Rad, Hercules, CA). Os dados são adquiridos num sistema Bio-Plex 200 e analisados com o software associado (Bio-Rad), e as concentrações de citocina são normalizadas para a concentração de proteína e transformadas em logaritmo.