Proteomische analyse onthult aangeboren immuunactiviteit bij darmtransplantatiedisfunctie

INLEIDING:

Dunne darmtransplantatie (ITx) biedt een mogelijke overlevingskans voor patiënten met darmfalen die levensbedreigende complicaties hebben ontwikkeld. Wereldwijd worden er jaarlijks ongeveer 200 ITx-procedures uitgevoerd, waarbij in totaal 2200 van dergelijke procedures zijn verricht, waarvan twee derde bij kinderen. Over het algemeen zijn de overlevingspercentages van patiënten en transplantaat de afgelopen jaren aanzienlijk verbeterd dankzij innovaties in chirurgische technieken, immunosuppressie en post-transplantatiebeheer. Eénjaarsoverlevingspercentages van patiënten benaderen 80-90% in ervaren centra. Desondanks blijft acute cellulaire afstoting (ACR) een grote uitdaging vormen bij deze patiënten.

Momenteel is de gouden standaard voor het diagnosticeren van ACR histologisch onderzoek van biopsiemonsters die tijdens endoscopie worden verkregen. Beperkingen zijn onder meer dat endoscopie per definitie invasief is, kostbaar, gepaard gaat met risico's op bloedingen, infectie of perforatie, en mogelijk onnauwkeurig. ACR kan zich voordoen als een vlekkerig proces dat tot 30% van de tijd gemist kan worden door endoscopische surveillance. Het presenteert zich ook op een vergelijkbare manier als infectie, wat leidt tot een diagnostisch dilemma over de optimale behandeling van de patiënt. Dergelijke vertragingen en onnauwkeurigheden in de diagnose en behandeling van ITx-ontvangers kunnen leiden tot verlies van patiënt en transplantaat. Nieuwe niet-invasieve technieken om ACR te monitoren zijn duidelijk nodig om het vakgebied van ITx verder vooruit te helpen.

Proteomics maakt de identificatie van eiwitten als mogelijke biomarkers mogelijk. Eiwitprofielen kunnen eenvoudig worden gedetecteerd in lichaamsvloeistoffen, waardoor deze eiwitcombinaties mogelijk innovatieve biomarkers zijn die nuttig zijn bij diagnose of ziektebewaking. Het volgen van eiwit- en metabolietniveaus kan een nauwkeurig screeningsinstrument blijken voor patiënten bij wie ACR wordt vermoed.

In deze studie gebruiken we high-throughput proteomicsanalyse en kandidaat-immunoassay-eiwitdetectie van stomavocht om op een niet-invasieve manier te zoeken naar moleculaire profielen van epitheliale stress en aangeboren immuniteit tijdens ACR.

IMMUNOSUPPRESSIE:

Alle patiënten worden behandeld met op tacrolimus gebaseerde drievoudige immunosuppressie. Ons standaard immunosuppressieregime omvat inductie met een interleukine-2-receptorantagonist zoals daclizumab of basiliximab, versus konijnen-antithymocytenglobuline. Onderhoudstherapie bestaat uit tacrolimus, corticosteroïden en mycofenolaatmofetil. Streefspiegels voor tacrolimus-trough zijn 10-15 ng/mL. Sirolimus wordt gebruikt als redmiddel en als onderdeel van een nierbesparend regime. ACR wordt gediagnosticeerd door histopathologie en behandeld met hoge doses steroïden. Bij patiënten met ernstige ACR wordt ATG gebruikt als redmiddel. Bij sterk gesensibiliseerde patiënten of patiënten bij wie antilichaam-gemedieerde afstoting wordt vermoed, wordt een combinatie van plasmaferese, Rituximab en IVIG gebruikt.

DARM SURVEILLANCE:

Protocolbiopten van de getransplanteerde darm worden eenmaal per week verkregen vanaf postoperatieve dag 7-14 gedurende de eerste 3-4 weken, daarna eenmaal per 2 weken tot 8 weken na ITx. Endoscopie en biopten worden ook verkregen voor klinische symptomen die wijzen op abnormale allograftfunctie. Meerdere gerichte biopten worden verkregen, en in paraffine ingebedde coupes gekleurd met hematoxyline en eosine (H&E) worden beoordeeld op ACR met behulp van standaard afstotingscriteria door een van de drie UCLA gastro-intestinale pathologen. Abnormale resultaten leiden tot verdere endoscopische surveillance zoals aangegeven.

STOMAVOCHTVERZAMELING EN PROTEOMISCHE EVALUATIE:

Stomavochten worden verzameld, direct op ijs geplaatst, en batchgewijs verwerkt in het UCLA High Throughput Clinical Proteomics massaspectrometrie kernlaboratorium. Alle monsters worden in drievoud verwerkt en geanalyseerd met behulp van MALDI-massaspectrometrie. MALDI-MS-spectra worden omgezet naar tekstbestanden en voorbewerkt met een vastgesteld protocol. De voorbewerkte MALDI-gegevens worden vervolgens geëxporteerd uit SpecAlign en verder geanalyseerd in R.

ENZYME LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY EN IMMUNOHISTOCHEMIE:

Humaan HNP 1-3 wordt in duplo verwerkte eiwitmonsters gekwantificeerd met een ELISA-kit volgens de instructies van de fabrikant (Cell Sciences, Canton, MA), met behulp van een HNP1-3 standaardcurve die voor elke plaat wordt opgesteld. Eiwitconcentraties worden ook bepaald voor elk testmonster (BCA, Pierce Thermo Scientific, Rockford, IL), en HNP1-3-niveaus worden genormaliseerd naar totaal eiwit (pg/mg).

Voor IHC worden biopsiecoupes gedeparaffineerd, geblokkeerd voor achtergrondperoxidaseactiviteit en geitenantilichaambinding volgens standaardmethoden, en gekleurd met humaan anti-HNP 1-3 antilichaam (konijn, 1:2000) of pre-geïmmuniseerd serum (konijn, 1:2000) als negatieve controle. De coupes worden verder geïncubeerd met een anti-Konijn IgG gebiotinyleerd secundair antilichaam en streptavidine-peroxidase geconjugeerd tertiair antilichaam uit de Vectastain Elite ABC-kit (Vector Laboratories) volgens het protocol van de fabrikant, en ontwikkeld door diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) substraatoplossing (Pierce, Rockford, IL). Voor IHC-kwantificatie worden 10 crypten in drie verschillende velden op de biopsieglaasje beoordeeld op aanwijzingen voor significante defensinekleuring. Het aantal defensine-positieve crypten wordt geteld en gemiddeld.

LUMINEX:

Een deel van het verwerkte stomavocht wordt gebruikt voor Luminex-evaluatie, met de Bio-Rad humane cytokine 17-plex assay volgens de instructies van de fabrikant (Bio-Rad, Hercules, CA). Gegevens worden verkregen op een Bio-Plex 200-systeem en geanalyseerd met bijbehorende software (Bio-Rad), en cytokineconcentraties worden genormaliseerd naar eiwitconcentratie en log-getransformeerd.