Omega-3 지방산으로 치료받은 비만 환자의 단핵 세포의 전사체 및 염증 상태

방법론 연구 설계. 이것은 전향적, 실험적, 비교, 비맹검(공개) 연구입니다.

성인 비만(BMI ≥ 35.0 kg/m2) 환자, 연령 25~45세, 모든 성별이 INCMNSZ의 외래 환자 비만 클리닉에서 모집됩니다. 환자는 인슐린 저항성이 있을 수도 있고 없을 수도 있지만 다음 중 어떤 것도 없어야 합니다. 여성, 임신 또는 수유.

대조군은 40명의 건강한 성인 비만이 아닌 지원자(BMI 18.5~23.0kg/m2)로 구성되며, 연령은 25~45세이며 성별에 관계없이 연구 참여를 수락합니다. 이 그룹은 처음(시간 0)에만 연구할 것이며 설명된 모든 변수에 대한 참조 값을 얻기 위해 생선 기름 보충제를 사용하기 때문에 생선 기름 보충제를 소비하지 않을 것입니다.

어유 보충제는 오메가-3 지방산(w-3 FA)의 공급원이 될 것이며 이것은 Inflammation Research Foundation(IRF, Boston MA)에서 병당 120캡슐이 들어 있는 표시가 없는 봉인된 병 형태로 기부될 것입니다.

각 1g 캡슐에는 0.6g의 w-3 FA(EPA 0.4g 및 DHA 0.2g)가 들어 있습니다. 4.8g의 w-3 FA를 제공하기 위해 각 비만 환자는 하루에 8캡슐을 섭취해야 합니다.

연구 디자인. 각 참가자(대조군 및 비만 환자)는 모집 시(시간 0) 1개월 동안 복용량을 충당하기에 충분한 어유 2병(240캡슐)을 받게 됩니다. 첫 달이 지나면 남은 캡슐(있는 경우)이 계산되고 다음 달 복용량을 충당하기 위해 새로운 보충제 2병이 제공됩니다. 이 전략은 +3달의 복용량을 커버하기 위해 +2달 말에 반복됩니다. 최소 1개월의 "워시 아웃" 기간이 관찰됩니다(월 +4). 설명된 모든 변수(인체 측정 제외)는 시간 0, +2 및 +4에서 분석됩니다.

인체 측정법. 신장(m), 체중(kg)은 [체중(kg)/신장(m)2] 공식으로 체질량 지수(BMI)를 계산하는 데 사용됩니다. 전신 구성 분석기 X-Contact 356을 사용하여 전기 생체 임피던스로 체성분을 측정하여 체지방량(% 및 kg) 및 무지방(제지방) 질량(% 및 kg)을 정량화합니다. 인체 측정은 시간 0과 +4에서만 수행됩니다.

혈액 샘플. 정맥혈은 항응고제(EDTA-K2)가 포함된 Vacutainer 시스템으로 0, +1, +2, +3 및 +4번에 채취됩니다. 혈액 분취량을 원심분리하여 혈장을 얻고 분석할 때까지 -80°C에서 보관합니다. 말초 혈액 단핵 세포(PBMNC)는 밀도 구배 원심분리(Lymphoprep)에 의해 얻어질 것이다. i) RNA-seq 및 qPCR에 의한 전사 분석, ii) 면역 세포 집단(B, T 및 단핵구)의 유세포분석 분석, iii) 세포 및 에너지 대사(해마), iv) "Treg-매개 세포 증식 억제(TMSCP)" 검정.

생화학 분석. 다음 대사산물, 지질, 사이토카인 및 아디포카인의 혈청 수치를 측정합니다: 포도당, 인슐린, 총 콜레스테롤, HDL, LDL, 트리글리세리드, 아디포카인(렙틴, 아디포넥틴, IL-6, TNFalpha, MCP1) 및 인터루킨(IL) 1베타 , 2, 4, 8, 10, 12, 17 및 TGF베타. 지방산 수준은 혈청 샘플 및 적혈구 및 백혈구(PBMNC)의 세포막에서 가스 크로마토그래피에 의해 결정됩니다. SPM(리졸빈, 프로텍틴 및 마레신)의 농도는 질량 분석계에 결합된 HPLC에 의해 결정됩니다.

PBMNC의 생체 에너지 분석. 세포 대사는 Seahorse XFe96 분석기(Agilent)로 분석하여 96-웰 플레이트 형식에서 살아있는 세포의 산소 소비율(OCR) 및 세포외 산성화율(ECAR)을 측정합니다. OCR 및 ECAR 속도는 각각 미토콘드리아 호흡 및 해당 작용의 주요 지표입니다. 이러한 에너지 소비 분석을 통해 "생물학적 건강 지수"(BHI)를 얻을 수 있습니다. 이 BHI는 세포가 사용하는 주요 에너지원을 반영하며 사용되는 대사 경로를 반영할 수 있습니다. 예를 들어, 많은 양의 OCR이 얻어지면 이는 호기성 대사(지방산 산화 및 산화적 인산화, 즉 FAO 및 OXPHOS)를 반영하는 반면, 높은 ECAR은 혐기성 대사를 나타내며 해당 작용이 사용되는 주요 대사 경로입니다.

유전자 발현의 전사 분석. Trizol 시약 및 이소프로판올 침전을 사용하여 PBMNC 및 하위 집단(즉, 단핵구 및 Treg 세포)으로부터 총 RNA를 얻을 것입니다. RNA 무결성은 전기영동에 의해 1% 아가로스 겔에서 결정되고 260nm에서 UV 분광광도계에 의해 농도가 결정됩니다.

RIN 값이 8 이상인 RNA 샘플은 시퀀싱에 사용됩니다. 상보적 DNA(cDNA)는 역전사효소 및 (dT)15 올리고뉴클레오티드로 합성됩니다. cDNA 조각의 끝은 시퀀싱 어댑터에 결찰되고 PCR로 증폭되어 시퀀싱 준비가 된 RNA-Seq 라이브러리를 생성합니다. 본 연구에서 사용되는 시퀀싱 방법은 Illumina 플랫폼을 사용한 차세대 시퀀싱(NGS)입니다. RNA-seq 분석에 의해 결정된 전사 수준의 변화 검증은 RotorGeneQ 열순환기 및 SybrGreen을 라벨로 사용하여 정량적 실시간 중합효소 연쇄 반응(qPCR)에 의해 결정됩니다. 18S rRNA는 하우스키핑 유전자로 사용됩니다.

RNA-Seq의 가장 강력한 용도는 둘 이상의 조건(예: 비만과 비만이 아님) 사이의 유전자 발현 차이를 찾는 것입니다. 이 과정을 미분 표현이라고 합니다. 출력은 흔히 차별적으로 발현된 유전자(DEG)라고 하며 이러한 유전자는 상향 또는 하향 조절될 수 있습니다(즉, 관심 조건에서 더 높거나 낮음). p 값과 2배 차이의 컷오프 포인트