Transcriptômica de Células Mononucleares e Estado Inflamatório de Pacientes Obesos Tratados com Ácidos Graxos Ômega-3

Metodologia Desenho do estudo. Este é um estudo prospectivo, experimental, comparativo, não cego (aberto).

Pacientes adultos obesos (IMC ≥ 35,0 kg/m2), com idade entre 25 e 45 anos, de qualquer sexo, serão recrutados no Ambulatório de Obesidade do INCMNSZ. Os pacientes podem ter (ou não) resistência à insulina, mas não devem ter nenhum dos seguintes: diabetes tipo 2 (controlada ou não), hipertensão, insuficiência hepática ou renal, síndrome metabólica, uso de antiinflamatórios ou suplementos alimentares e, no caso de mulheres, grávidas ou lactantes.

O grupo controle será composto por 40 voluntários saudáveis ​​adultos não obesos (IMC 18,5 a 23,0 kg/m2), com idade entre 25 e 45 anos, de qualquer gênero que aceitem participar do estudo. Este grupo será estudado apenas no início (tempo 0) e não consumirá o suplemento de óleo de peixe, pois seu uso será para obtenção de valores de referência para todas as variáveis ​​descritas.

O suplemento de óleo de peixe será a fonte de ácidos graxos ômega-3 (w-3 FA) e será uma doação da Inflammation Research Foundation (IRF, Boston MA), na forma de frascos selados e não marcados com 120 cápsulas/frasco.

Cada cápsula de 1 grama contém 0,6 g de w-3 FA (0,4 g de EPA e 0,2 g de DHA). Para fornecer 4,8 g de w-3 FA cada paciente obeso deve consumir 8 cápsulas/dia, assim distribuídas: 2 cápsulas no café da manhã, 4 cápsulas na refeição principal e 2 cápsulas no jantar.

Design de estudo. Cada participante (sujeitos de controle e pacientes obesos) receberá 2 frascos (240 cápsulas) de óleo de peixe no momento do recrutamento (tempo 0), o que é suficiente para cobrir a dosagem por 1 mês. Após o primeiro mês, as cápsulas restantes (se houver) serão contadas e 2 novos frascos de suplemento serão fornecidos para cobrir a dosagem do mês seguinte. Esta estratégia será repetida no final do mês +2 para cobrir a dosagem do mês +3. Será observado um período de "wash-out" de pelo menos 1 mês (mês +4). Todas as variáveis ​​descritas (exceto antropometria) serão analisadas nos tempos 0, +2 e +4.

Antropometria. Altura em metros (m), peso em quilogramas (kg), será utilizado para calcular o índice de massa corporal (IMC) com a fórmula [peso (kg)/ altura (m)2]. A composição corporal será determinada por bioimpedância elétrica com Full Body Composition Analyzer X-Contact 356, para quantificar a massa gorda (em % e em kg) e a massa isenta de gordura (magra) (em % e kg). A antropometria será realizada apenas nos tempos 0 e +4.

Amostras de sangue. O sangue venoso será obtido nos tempos 0, +1, +2, +3 e +4 com o sistema Vacutainer com anticoagulante (EDTA-K2). Uma alíquota de sangue será centrifugada para obter plasma e armazenada a -80°C até ser analisada. Células mononucleares de sangue periférico (PBMNC) serão obtidas por centrifugação em gradiente de densidade (Lymphoprep). Essas células serão posteriormente processadas para as seguintes determinações: i) análise transcricional por RNA-seq e qPCR, ii) análise por citometria de fluxo de populações de células imunes (B, T e monócitos), iii) metabolismo celular e energético (Seahorse) e, iv) o ensaio "supressão da proliferação celular mediada por Treg (TMSCP)".

Análise bioquímica. Serão determinados os níveis séricos dos seguintes metabólitos, lipídios, citocinas e adipocinas: glicose, insulina, colesterol total, HDL, LDL, triglicerídeos, adipocinas (leptina, adiponectina, IL-6, TNFalfa, MCP1) e interleucina (IL) 1beta , 2, 4, 8, 10, 12, 17 e TGFbeta. Os níveis de ácidos graxos serão determinados por cromatografia gasosa em amostras de soro e em membranas celulares de eritrócitos e leucócitos (PBMNC). A concentração de SPM (resolvinas, protectinas e maresinas) será determinada por HPLC acoplada a um espectrômetro de massas.

Análise bioenergética de PBMNC. O metabolismo celular será analisado com um Seahorse XFe96 Analyzer (Agilent) para medir a taxa de consumo de oxigênio (OCR) e taxa de acidificação extracelular (ECAR) de células vivas em um formato de placa de 96 poços. As taxas de OCR e ECAR são indicadores-chave da respiração mitocondrial e da glicólise, respectivamente. A partir dessa análise do consumo de energia, será obtido um "índice de saúde bioenergética" (BHI). Este BHI reflete a fonte dominante de energia empregada pelas células e pode refletir a via metabólica empregada. Por exemplo, se uma alta quantidade de OCR é obtida, isso reflete um metabolismo aeróbico (oxidação de ácidos graxos e fosforilação oxidativa, ou seja, FAO e OXPHOS), enquanto um alto ECAR indica metabolismo anaeróbico e a glicólise é a principal via metabólica empregada.

Análise transcricional da expressão gênica. O ARN total será obtido a partir de PBMNC e subpopulações (nomeadamente, monócitos e células Treg) utilizando o reagente Trizol e precipitação com isopropanol. A integridade do RNA será determinada em géis de agarose 1% por eletroforese e sua concentração por espectrofotometria UV a 260nm.

Amostras de RNA com valores de RIN de 8 e superiores serão usadas para sequenciamento; DNA complementar (cDNA) será sintetizado com transcriptase reversa e oligonucleotídeos (dT)15. As extremidades dos fragmentos de cDNA serão ligadas a adaptadores de sequenciamento e amplificadas por PCR para produzir a biblioteca de RNA-Seq, que estará pronta para sequenciamento. O método de sequenciamento utilizado no presente estudo será o sequenciamento de próxima geração (NGS) com a plataforma Illumina. A validação das alterações no nível de transcrição determinado pela análise de RNA-seq, será determinada pela reação quantitativa em cadeia da polimerase em tempo real (qPCR) usando um termociclador RotorGeneQ e SybrGreen como marcador. O rRNA 18S será usado como gene de manutenção.

O uso mais poderoso do RNA-Seq é encontrar diferenças na expressão gênica entre duas ou mais condições (por exemplo, obeso versus não obeso); esse processo é chamado de expressão diferencial. As saídas são frequentemente referidas como genes expressos diferencialmente (DEGs) e esses genes podem ser regulados para cima ou para baixo (isto é, mais alto ou mais baixo na condição de interesse). Um ponto de corte de 2 vezes a diferença com um valor p