Transkriptomika mononukleárních buněk a zánětlivý stav obézních pacientů léčených omega-3 mastnými kyselinami

Metodologie Návrh studie. Jedná se o prospektivní, experimentální, srovnávací, nezaslepenou (otevřenou) studii.

Dospělí obézní (BMI ≥ 35,0 kg/m2) pacienti, věk 25 až 45 let, jakéhokoli pohlaví, budou rekrutováni z obezitologické ambulance INCMNSZ. Pacienti mohou mít (nebo ne) inzulinovou rezistenci, ale nesmějí mít nic z následujícího: diabetes 2. typu (kontrolovaný nebo nekontrolovaný), hypertenzi, selhání jater nebo ledvin, metabolický syndrom, užívání protizánětlivých léků nebo doplňků stravy a popř. žen, těhotných nebo kojících.

Kontrolní skupina se bude skládat ze 40 zdravých dospělých neobézních dobrovolníků (BMI 18,5 až 23,0 kg/m2), věku 25 až 45 let, jakéhokoli pohlaví, kteří souhlasí s účastí ve studii. Tato skupina bude studována pouze na začátku (čas 0) a nebude konzumovat doplněk rybího tuku, protože jeho použití bude sloužit k získání referenčních hodnot pro všechny popsané proměnné.

Doplněk rybího oleje bude zdrojem omega-3 mastných kyselin (w-3 FA) a bude to dar od Nadace pro výzkum zánětu (IRF, Boston MA), ve formě zapečetěných neoznačených lahviček se 120 kapslemi/lahev.

Každá 1 gramová kapsle obsahuje 0,6 g w-3 FA (0,4 g EPA a 0,2 g DHA). Pro poskytnutí 4,8 g w-3 FA musí každý obézní pacient zkonzumovat 8 kapslí/den, rozdělených následovně: 2 kapsle při snídani, 4 kapsle s hlavním jídlem a 2 kapsle při večeři.

Studovat design. Každý účastník (kontrolní subjekty a obézní pacienti) obdrží 2 lahvičky (240 kapslí) rybího oleje v době náboru (čas 0), což stačí na pokrytí dávky na 1 měsíc. Po uplynutí prvního měsíce se spočítají zbývající kapsle (pokud nějaké existují) a budou poskytnuty 2 nové lahvičky suplementu na pokrytí dávkování na následující měsíc. Tato strategie se bude opakovat na konci měsíce +2, aby pokryla dávku měsíce +3. Bude dodržena „vymývací“ doba minimálně 1 měsíc (měsíc +4). Všechny popsané proměnné (kromě antropometrie) budou analyzovány v časech 0, +2 a +4.

Antropometrie. Výška v metrech (m), hmotnost v kilogramech (kg) se použije pro výpočet indexu tělesné hmotnosti (BMI) pomocí vzorce [hmotnost (kg)/výška (m)2]. Tělesné složení bude určeno elektrickou bioimpedancí s Full Body Composition Analyzer X-Contact 356, aby se kvantifikovala tuková hmota (v % a v kg) a beztuková (libová) hmota (v % a kg). Antropometrie bude prováděna pouze v časech 0 a +4.

Vzorky krve. Venózní krev bude odebrána v časech 0, +1, +2, +3 a +4 systémem Vacutainer s antikoagulantem (EDTA-K2). Alikvot krve se odstředí, aby se získala plazma, a skladuje se při -80 °C až do testování. Mononukleární buňky periferní krve (PBMNC) budou získány centrifugací v hustotním gradientu (Lymphoprep). Tyto buňky budou dále zpracovány pro následující stanovení: i) transkripční analýza pomocí RNA-seq a qPCR, ii) průtoková cytometrická analýza populací imunitních buněk (B, T a monocyty), iii) buněčný a energetický metabolismus (Seahorse) a, iv) test "Treg-zprostředkované potlačení buněčné proliferace (TMSCP)".

Biochemická analýza. Budou stanoveny sérové ​​hladiny následujících metabolitů, lipidů, cytokinů a adipokinů: glukóza, inzulín, celkový cholesterol, HDL, LDL, triglyceridy, adipokiny (leptin, adiponektin, IL-6, TNFalfa, MCP1) a interleukin (IL) 1beta , 2, 4, 8, 10, 12, 17 a TGFbeta. Hladiny mastných kyselin budou stanoveny plynovou chromatografií ve vzorcích séra a v buněčných membránách z erytrocytů a leukocytů (PBMNC). Koncentrace SPM (resolviny, protektiny a maresiny) bude stanovena pomocí HPLC spojené s hmotnostním spektrometrem.

Bioenergetická analýza PBMNC. Buněčný metabolismus bude analyzován pomocí analyzátoru Seahorse XFe96 (Agilent), aby se změřila rychlost spotřeby kyslíku (OCR) a rychlost extracelulární acidifikace (ECAR) živých buněk na 96jamkové destičce. Frekvence OCR a ECAR jsou klíčovými indikátory mitochondriálního dýchání a glykolýzy. Z této analýzy spotřeby energie bude získán „bioenergetický index zdraví“ (BHI). Tento BHI odráží dominantní zdroj energie využívaný buňkami a může odrážet použitou metabolickou dráhu. Například, pokud je získáno vysoké množství OCR, odráží to aerobní metabolismus (oxidace mastných kyselin a oxidativní fosforylace, tj. FAO a OXPHOS), zatímco vysoký ECAR indikuje anaerobní metabolismus a glykolýza je hlavní použitou metabolickou cestou.

Transkripční analýza genové exprese. Celková RNA bude získána z PBMNC a subpopulací (jmenovitě monocytů a Treg buněk) za použití činidla Trizol a precipitace isopropanolem. Integrita RNA bude stanovena v 1% agarózových gelech elektroforézou a její koncentrace UV spektrofotometrií při 260 nm.

Vzorky RNA s hodnotami RIN 8 a vyššími budou použity pro sekvenování; komplementární DNA (cDNA) bude syntetizována s reverzní transkriptázou a (dT)15 oligonukleotidy. Konce cDNA fragmentů budou ligovány do sekvenačních adaptérů a amplifikovány pomocí PCR za vzniku knihovny RNA-Seq, která bude připravena pro sekvenování. Metoda sekvenování použitá v této studii bude sekvenování nové generace (NGS) s platformou Illumina. Validace změn v úrovni transkripce stanovené analýzou RNA-seq bude stanovena kvantitativní polymerázovou řetězovou reakcí v reálném čase (qPCR) s použitím termocykleru RotorGeneQ a značky SybrGreen. 18S rRNA bude použita jako provozní gen.

Nejúčinnějším využitím RNA-Seq je nalezení rozdílů v genové expresi mezi dvěma nebo více stavy (např. obézní versus neobézní); tento proces se nazývá diferenciální vyjádření. Výstupy se často označují jako diferenciálně exprimované geny (DEGs) a tyto geny mohou být buď up- nebo down-regulovány (tj. vyšší nebo nižší v zájmovém stavu). Mezní bod 2násobného rozdílu s hodnotou p