Transkriptomik von mononukleären Zellen und Entzündungsstatus von adipösen Patienten, die mit Omega-3-Fettsäuren behandelt wurden

Methodik Studiendesign. Dies ist eine prospektive, experimentelle, vergleichende, nicht verblindete (offene) Studie.

Erwachsene adipöse (BMI ≥ 35,0 kg/m2) Patienten im Alter von 25 bis 45 Jahren jeden Geschlechts werden aus der ambulanten Klinik für Adipositas am INCMNSZ rekrutiert. Die Patienten können (oder nicht) Insulinresistenz haben, dürfen aber keines der Folgenden haben: Typ-2-Diabetes (kontrolliert oder nicht), Bluthochdruck, Leber- oder Nierenversagen, metabolisches Syndrom, Einnahme von entzündungshemmenden Medikamenten oder Nahrungsergänzungsmitteln und in dem Fall von schwangeren oder stillenden Frauen.

Die Kontrollgruppe besteht aus 40 gesunden, erwachsenen, nicht übergewichtigen Freiwilligen (BMI 18,5 bis 23,0 kg/m2) im Alter von 25 bis 45 Jahren jeden Geschlechts, die einer Teilnahme an der Studie zustimmen. Diese Gruppe wird nur zu Beginn (Zeitpunkt 0) untersucht und sie wird das Fischöl-Supplement nicht konsumieren, da es dazu dient, Referenzwerte für alle beschriebenen Variablen zu erhalten.

Fischölergänzung wird die Quelle von Omega-3-Fettsäuren (w-3 FA) sein und dies wird eine Spende der Inflammation Research Foundation (IRF, Boston, MA) in Form von versiegelten, nicht gekennzeichneten Flaschen mit 120 Kapseln/Flasche sein.

Jede 1-Gramm-Kapsel enthält 0,6 g w-3 FA (0,4 g EPA und 0,2 g DHA). Um 4,8 g w-3 FA bereitzustellen, muss jeder adipöse Patient 8 Kapseln/Tag zu sich nehmen, verteilt wie folgt: 2 Kapseln zum Frühstück, 4 Kapseln zur Hauptmahlzeit und 2 Kapseln zum Abendessen.

Studiendesign. Jeder Teilnehmer (Kontrollpersonen und übergewichtige Patienten) erhält zum Zeitpunkt der Rekrutierung (Zeitpunkt 0) 2 Flaschen (240 Kapseln) des Fischöls, was ausreicht, um die Dosierung für 1 Monat abzudecken. Nach Ablauf des ersten Monats werden die verbleibenden Kapseln (falls vorhanden) gezählt und 2 neue Flaschen des Nahrungsergänzungsmittels werden bereitgestellt, um die Dosierung des folgenden Monats abzudecken. Diese Strategie wird am Ende des Monats +2 wiederholt, um die Dosierung des Monats +3 abzudecken. Es wird eine "Wash-out"-Periode von mindestens 1 Monat eingehalten (Monat +4). Alle beschriebenen Variablen (außer Anthropometrie) werden zu den Zeitpunkten 0, +2 und +4 analysiert.

Anthropometrie. Größe in Metern (m), Gewicht in Kilogramm (kg), wird zur Berechnung des Body Mass Index (BMI) mit der Formel [Gewicht (kg)/ Größe (m)2] verwendet. Die Körperzusammensetzung wird durch elektrische Bioimpedanz mit einem Full Body Composition Analyzer X-Contact 356 bestimmt, um die Fettmasse (in % und in kg) und die fettfreie (magere) Masse (in % und kg) zu quantifizieren. Anthropometrie wird nur zu den Zeiten 0 und +4 durchgeführt.

Blutproben. Venöses Blut wird zu den Zeiten 0, +1, +2, +3 und +4 mit dem Vacutainer-System mit Gerinnungshemmer (EDTA-K2) entnommen. Ein Blutaliquot wird zentrifugiert, um Plasma zu erhalten, und bis zur Untersuchung bei -80 °C gelagert. Periphere mononukleäre Blutzellen (PBMNC) werden durch Dichtegradientenzentrifugation (Lymphoprep) gewonnen. Diese Zellen werden für die folgenden Bestimmungen weiterverarbeitet: i) Transkriptionsanalyse durch RNA-seq und qPCR, ii) Durchflusszytometrie-Analyse von Immunzellpopulationen (B, T und Monozyten), iii) Zell- und Energiestoffwechsel (Seepferdchen) und, iv) der "Treg-vermittelte Unterdrückung der Zellproliferation (TMSCP)"-Assay.

Biochemische Analyse. Die Serumspiegel der folgenden Metaboliten, Lipide, Zytokine und Adipokine werden bestimmt: Glukose, Insulin, Gesamtcholesterin, HDL, LDL, Triglyceride, Adipokine (Leptin, Adiponectin, IL-6, TNFalpha, MCP1) und Interleukin (IL) 1beta , 2, 4, 8, 10, 12, 17 und TGFbeta. Fettsäurespiegel werden durch Gaschromatographie in Serumproben und in Zellmembranen von Erythrozyten und Leukozyten (PBMNC) bestimmt. Die Konzentration von SPM (Resolvine, Protectine und Maresine) wird durch HPLC bestimmt, das mit einem Massenspektrometer gekoppelt ist.

Bioenergetische Analyse von PBMNC. Der Zellstoffwechsel wird mit einem Seahorse XFe96 Analyzer (Agilent) analysiert, um die Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) und die extrazelluläre Ansäuerungsrate (ECAR) von lebenden Zellen in einem Plattenformat mit 96 Vertiefungen zu messen. OCR- und ECAR-Raten sind Schlüsselindikatoren für die mitochondriale Atmung bzw. Glykolyse. Aus dieser Analyse des Energieverbrauchs wird ein „Bioenergetischer Gesundheitsindex“ (BHI) ermittelt. Dieser BHI spiegelt die dominante Energiequelle wider, die von den Zellen verwendet wird, und kann den verwendeten Stoffwechselweg widerspiegeln. Wenn zum Beispiel eine hohe OCR-Menge erhalten wird, spiegelt dies einen aeroben Metabolismus wider (Fettsäureoxidation und oxidative Phosphorylierung, dh FAO und OXPHOS), während ein hoher ECAR einen anaeroben Metabolismus anzeigt und die Glykolyse der hauptsächlich verwendete Stoffwechselweg ist.

Transkriptionsanalyse der Genexpression. Gesamt-RNA wird aus PBMNC und Subpopulationen (nämlich Monozyten und Treg-Zellen) unter Verwendung des Trizol-Reagens und Isopropanol-Präzipitation erhalten. Die RNA-Integrität wird in 1 % Agarosegelen durch Elektrophorese und ihre Konzentration durch UV-Spektrophotometrie bei 260 nm bestimmt.

RNA-Proben mit RIN-Werten von 8 und höher werden für die Sequenzierung verwendet; komplementäre DNA (cDNA) wird mit reverser Transkriptase und (dT)15-Oligonukleotiden synthetisiert. Die Enden der cDNA-Fragmente werden an Sequenzierungsadapter ligiert und durch PCR amplifiziert, um die RNA-Seq-Bibliothek zu erstellen, die für die Sequenzierung bereit ist. Die in der vorliegenden Studie verwendete Sequenzierungsmethode ist die Sequenzierung der nächsten Generation (NGS) mit der Illumina-Plattform. Die Validierung von Änderungen im Transkriptionsniveau, die durch RNA-Seq-Analyse bestimmt werden, wird durch quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) unter Verwendung eines RotorGeneQ-Thermocyclers und SybrGreen als Markierung bestimmt. Als Housekeeping-Gen wird 18S rRNA verwendet.

Die stärkste Verwendung von RNA-Seq besteht darin, Unterschiede in der Genexpression zwischen zwei oder mehr Zuständen zu finden (z. B. fettleibig vs. nicht fettleibig); Dieser Vorgang wird Differentialausdruck genannt. Die Ausgänge werden häufig als differentiell exprimierte Gene (DEGs) bezeichnet, und diese Gene können entweder hoch- oder herunterreguliert werden (d. h. höher oder niedriger in der interessierenden Bedingung). Ein Grenzwert der 2-fachen Differenz mit einem p-Wert