Transkriptomikk av mononukleære celler og inflammatorisk status for overvektige pasienter behandlet med omega-3 fettsyrer

Metodikk Studiedesign. Dette er en prospektiv, eksperimentell, komparativ, ikke-blind (åpen) studie.

Voksne pasienter med overvekt (BMI ≥ 35,0 kg/m2), i alderen 25 til 45 år, uansett kjønn, vil bli rekruttert fra poliklinikken for fedme ved INCMNSZ. Pasientene kan ha (eller ikke) insulinresistens, men må ikke ha noen av følgende: diabetes type 2 (kontrollert eller ikke), hypertensjon, lever- eller nyresvikt, metabolsk syndrom, tar antiinflammatoriske legemidler eller kosttilskudd, og i tilfelle kvinner, gravide eller ammende.

Kontrollgruppen vil bestå av 40 friske voksne ikke-overvektige frivillige (BMI 18,5 til 23,0 kg/m2), i alderen 25 til 45 år, uansett kjønn som godtar å delta i studien. Denne gruppen vil kun bli studert i begynnelsen (tidspunkt 0) og de vil ikke konsumere fiskeoljetilskuddet, siden bruken vil være å få referanseverdier for alle variabler beskrevet.

Fiskeoljetilskudd vil være kilden til omega-3 fettsyrer (w-3 FA) og dette vil være en donasjon fra Inflammation Research Foundation (IRF, Boston MA), i form av forseglede umerkede flasker med 120 kapsler/flaske.

Hver 1 gram kapsel inneholder 0,6 g w-3 FA (0,4 g EPA og 0,2 g DHA). For å gi 4,8 g w-3 FA må hver overvektig pasient innta 8 kapsler/dag, fordelt som følger: 2 kapsler til frokost, 4 kapsler til hovedmåltidet og 2 kapsler til middag.

Studere design. Hver deltaker (kontrollpersoner og overvektige pasienter) vil motta 2 flasker (240 kapsler) med fiskeoljen ved rekrutteringstidspunktet (tid 0) som er nok til å dekke doseringen i 1 måned. Etter at den første måneden har gått, vil de resterende kapslene (hvis noen) telles og 2 nye flasker med supplement vil bli gitt for å dekke dosen for den påfølgende måneden. Denne strategien vil bli gjentatt i slutten av måned +2 for å dekke doseringen av måned +3. En "utvaskingsperiode" på minst 1 måned vil bli observert (måned +4). Alle variabler beskrevet (unntatt antropometri) vil bli analysert til tidene 0, +2 og +4.

Antropometri. Høyde i meter (m), vekt i kilogram (kg), vil bli brukt til å beregne kroppsmasseindeksen (BMI) med formelen [vekt (kg)/ høyde (m)2]. Kroppssammensetningen vil bli bestemt av elektrisk bioimpedans med en Full Body Composition Analyzer X-Contact 356, for å kvantifisere fettmassen (i % og i kg) og den fettfrie (magre) massen (i % og kg). Antropometri vil bare bli utført på tidene 0 og +4.

Blodprøver. Venøst ​​blod vil bli oppnådd til tidene 0, +1, +2, +3 og +4 med Vacutainer-systemet med antikoagulant (EDTA-K2). En alikvot av blod vil bli sentrifugert for å oppnå plasma og lagret ved -80°C inntil analysert. Perifere mononukleære blodceller (PBMNC) vil bli oppnådd ved tetthetsgradientsentrifugering (Lymphoprep). Disse cellene vil bli viderebehandlet for følgende bestemmelser: i) transkripsjonsanalyse ved RNA-seq og qPCR, ii) flowcytometrianalyse av immuncellepopulasjoner (B, T og monocytter), iii) cellulær og energimetabolisme (Seahorse) og, iv) "Treg-mediert undertrykkelse av cellulær proliferasjon (TMSCP)"-analysen.

Biokjemisk analyse. Serumnivåer av følgende metabolitter, lipider, cytokiner og adipokiner vil bli bestemt: glukose, insulin, totalkolesterol, HDL, LDL, triglyserider, adipokiner (leptin, adiponectin, IL-6, TNFalpha, MCP1) og interleukin (IL) 1beta , 2, 4, 8, 10, 12, 17 og TGFbeta. Fettsyrenivåer vil bli bestemt ved gasskromatografi i serumprøver, og i cellulære membraner fra erytrocytter og leukocytter (PBMNC). Konsentrasjonen av SPM (resolviner, protectiner og maresiner) vil bli bestemt ved HPLC koblet til et massespektrometer.

Bioenergetisk analyse av PBMNC. Cellulær metabolisme vil bli analysert med en Seahorse XFe96 Analyzer (Agilent) for å måle oksygenforbrukshastighet (OCR) og ekstracellulær surhetsgrad (ECAR) av levende celler i et 96-brønns plateformat. OCR- og ECAR-frekvenser er nøkkelindikatorer for henholdsvis mitokondriell respirasjon og glykolyse. Fra denne analysen av energiforbruket vil en "bioenergetisk helseindeks" (BHI) fås. Denne BHI reflekterer den dominerende energikilden som brukes av cellene og kan reflektere den metabolske veien som brukes. For eksempel, hvis en høy mengde OCR oppnås, reflekterer dette en aerob metabolisme (fettsyreoksidasjon og oksidativ fosforylering, dvs. FAO og OXPHOS), mens en høy ECAR indikerer anaerob metabolisme og glykolyse er den viktigste metabolske veien som brukes.

Transkripsjonsanalyse av genuttrykk. Totalt RNA vil bli hentet fra PBMNC og subpopulasjoner (nemlig monocytter og Treg-celler) ved bruk av Trizol-reagens og isopropanolutfelling. RNA-integritet vil bli bestemt i 1% agarosegeler ved elektroforese og konsentrasjonen ved UV-spektrofotometri ved 260nm.

Prøver av RNA med RIN-verdier på 8 og høyere vil brukes til sekvensering; komplementært DNA (cDNA) vil bli syntetisert med revers-transkriptase og (dT)15-oligonukleotider. Endene av cDNA-fragmentene vil bli ligert til sekvenseringsadaptere og amplifisert ved PCR for å produsere RNA-Seq-biblioteket, som vil være klart for sekvensering. Sekvenseringsmetoden som brukes i denne studien vil være neste generasjons sekvensering (NGS) med Illumina-plattformen. Validering av endringer i transkripsjonsnivået bestemt ved RNA-seq analyse, vil bli bestemt ved kvantitativ sanntids polymerasekjedereaksjon (qPCR) ved bruk av en RotorGeneQ termosykler og SybrGreen som etikett. 18S rRNA vil bli brukt som husholdningsgen.

Den kraftigste bruken av RNA-Seq er å finne forskjeller i genuttrykk mellom to eller flere tilstander (f.eks. overvektig vs ikke overvektig); denne prosessen kalles differensielt uttrykk. Utgangene blir ofte referert til som differensielt uttrykte gener (DEG), og disse genene kan enten opp- eller nedreguleres (dvs. høyere eller lavere i tilstanden av interesse). Et grensepunkt på 2 ganger forskjell med en p-verdi