Transcriptómica de células mononucleares y estado inflamatorio de pacientes obesos tratados con ácidos grasos omega-3

Metodología Diseño del estudio. Este es un estudio prospectivo, experimental, comparativo, no ciego (abierto).

Se reclutarán pacientes adultos obesos (IMC ≥ 35.0 kg/m2), de 25 a 45 años de edad, de cualquier género, de la Clínica de Obesidad ambulatoria del INCMNSZ. Los pacientes pueden tener (o no) resistencia a la insulina, pero no deben tener ninguno de los siguientes: diabetes tipo 2 (controlada o no), hipertensión, insuficiencia hepática o renal, síndrome metabólico, tomar antiinflamatorios o suplementos dietéticos, y en su caso de mujeres, embarazadas o lactantes.

El grupo control estará formado por 40 voluntarios adultos sanos no obesos (IMC 18,5 a 23,0 kg/m2), de 25 a 45 años de edad, de cualquier sexo que acepten participar en el estudio. Este grupo solo será estudiado al inicio (tiempo 0) y no consumirá el suplemento de aceite de pescado, ya que su uso será obtener valores de referencia para todas las variables descritas.

El suplemento de aceite de pescado será la fuente de ácidos grasos omega-3 (w-3 FA) y será una donación de Inflammation Research Foundation (IRF, Boston MA), en forma de botellas selladas sin marcar con 120 cápsulas/botella.

Cada cápsula de 1 gramo contiene 0,6 g de w-3 FA (0,4 g de EPA y 0,2 g de DHA). Para aportar 4,8 g de w-3 AF cada paciente obeso debe consumir 8 cápsulas/día, repartidas de la siguiente manera: 2 cápsulas en el desayuno, 4 cápsulas con la comida principal y 2 cápsulas en la cena.

Diseño del estudio. Cada participante (sujetos de control y pacientes obesos) recibirá 2 botellas (240 cápsulas) del aceite de pescado en el momento del reclutamiento (tiempo 0) que es suficiente para cubrir la dosis de 1 mes. Transcurrido el primer mes, se contarán las cápsulas restantes (si las hubiera) y se entregarán 2 nuevos frascos de suplemento para cubrir la dosis del mes siguiente. Esta estrategia se repetirá al final del mes +2 para cubrir la dosis del mes +3. Se observará un período de "lavado" de al menos 1 mes (mes +4). Todas las variables descritas (excepto la antropometría) serán analizadas en los tiempos 0, +2 y +4.

Antropometría. La altura en metros (m), el peso en kilogramos (kg), se utilizará para calcular el índice de masa corporal (IMC) con la fórmula [peso (kg)/ altura (m)2]. Se determinará la composición corporal por bioimpedancia eléctrica con un Full Body Composition Analyzer X-Contact 356, para cuantificar la masa grasa (en % y en kg) y la masa magra (en % y kg). La antropometría se realizará únicamente en los tiempos 0 y +4.

Muestras de sangre. La sangre venosa se obtendrá en los tiempos 0, +1, +2, +3 y +4 con el sistema Vacutainer con anticoagulante (EDTA-K2). Se centrifugará una alícuota de sangre para obtener plasma y se almacenará a -80 °C hasta que se analice. Las células mononucleares de sangre periférica (PBMNC) se obtendrán mediante centrifugación en gradiente de densidad (Lymphoprep). Estas células serán procesadas adicionalmente para las siguientes determinaciones: i) análisis transcripcional por RNA-seq y qPCR, ii) análisis de citometría de flujo de poblaciones de células inmunes (B, T y monocitos), iii) metabolismo celular y energético (Seahorse) y, iv) el ensayo de "supresión de la proliferación celular mediada por Treg (TMSCP)".

Análisis bioquímico. Se determinarán los niveles séricos de los siguientes metabolitos, lípidos, citocinas y adipocinas: glucosa, insulina, colesterol total, HDL, LDL, triglicéridos, adipocinas (leptina, adiponectina, IL-6, TNFalfa, MCP1) e interleucina (IL) 1beta , 2, 4, 8, 10, 12, 17 y TGFbeta. Los niveles de ácidos grasos se determinarán por cromatografía de gases en muestras de suero y en membranas celulares de eritrocitos y leucocitos (PBMNC). La concentración de SPM (resolvinas, protectinas y maresinas) se determinará mediante HPLC acoplada a un espectrómetro de masas.

Análisis bioenergético de PBMNC. El metabolismo celular se analizará con un analizador Seahorse XFe96 (Agilent) para medir la tasa de consumo de oxígeno (OCR) y la tasa de acidificación extracelular (ECAR) de células vivas en un formato de placa de 96 pocillos. Las tasas de OCR y ECAR son indicadores clave de la respiración mitocondrial y la glucólisis, respectivamente. A partir de este análisis del consumo energético se obtendrá un “índice de salud bioenergética” (BHI). Este BHI refleja la fuente dominante de energía empleada por las células y puede reflejar la ruta metabólica empleada. Por ejemplo, si se obtiene una cantidad alta de OCR, esto refleja un metabolismo aeróbico (oxidación de ácidos grasos y fosforilación oxidativa, es decir, FAO y OXPHOS), mientras que un ECAR alto indica metabolismo anaeróbico y la glucólisis es la principal vía metabólica empleada.

Análisis transcripcional de la expresión génica. El ARN total se obtendrá de PBMNC y subpoblaciones (es decir, monocitos y células Treg) utilizando el reactivo Trizol y la precipitación con isopropanol. Se determinará la integridad del ARN en geles de agarosa al 1% por electroforesis y su concentración por espectrofotometría UV a 260nm.

Las muestras de ARN con valores RIN de 8 y superiores se utilizarán para la secuenciación; El ADN complementario (ADNc) se sintetizará con transcriptasa inversa y oligonucleótidos (dT)15. Los extremos de los fragmentos de cDNA se ligarán a los adaptadores de secuenciación y se amplificarán mediante PCR para producir la biblioteca de RNA-Seq, que estará lista para la secuenciación. El método de secuenciación utilizado en el presente estudio será la secuenciación de próxima generación (NGS) con la plataforma Illumina. La validación de los cambios en el nivel de transcripción determinados por el análisis de RNA-seq se determinará mediante la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (qPCR) utilizando un termociclador RotorGeneQ y SybrGreen como marcador. Se usará 18S rRNA como gen de mantenimiento.

El uso más poderoso de RNA-Seq es encontrar diferencias en la expresión génica entre dos o más condiciones (p. ej., obeso frente a no obeso); este proceso se llama expresión diferencial. Los resultados se denominan con frecuencia genes expresados ​​diferencialmente (DEG) y estos genes pueden regularse hacia arriba o hacia abajo (es decir, más o menos en la condición de interés). Un punto de corte de 2 veces la diferencia con un valor p