Omega-3-rasvahapoilla hoidettujen liikalihavien potilaiden mononukleaaristen solujen transkriptomiikka ja tulehdustila

Metodologia Tutkimuksen suunnittelu. Tämä on prospektiivinen, kokeellinen, vertaileva, ei-sokkoutettu (avoin) tutkimus.

Lihavia aikuisia (BMI ≥ 35,0 kg/m2), iältään 25–45-vuotiaita, mitä tahansa sukupuolta, rekrytoidaan INCMNSZ:n liikalihavuuden poliklinikalta. Potilailla voi olla (tai ei) insuliiniresistenssiä, mutta heillä ei saa olla mitään seuraavista: tyypin 2 diabetes (hallinnassa tai ei), verenpainetauti, maksan tai munuaisten vajaatoiminta, metabolinen oireyhtymä, tulehduskipulääkkeiden tai ravintolisien käyttö ja raskaana oleville tai imettäville naisille.

Kontrolliryhmään kuuluu 40 tervettä aikuista ei-lihavaa vapaaehtoista (BMI 18,5 - 23,0 kg/m2), iältään 25 - 45 vuotta, riippumatta sukupuolesta, jotka suostuvat osallistumaan tutkimukseen. Tätä ryhmää tutkitaan vain alussa (aika 0), eivätkä he käytä kalaöljylisää, koska sen avulla saadaan vertailuarvot kaikille kuvatuille muuttujille.

Kalaöljylisä on omega-3-rasvahappojen (w-3 FA) lähde, ja tämä on Inflammation Research Foundationin (IRF, Boston MA) lahjoitus suljetuissa merkitsemättömissä pulloissa, joissa on 120 kapselia/pullo.

Jokainen 1 gramman kapseli sisältää 0,6 g w-3 FA:ta (0,4 g EPA:ta ja 0,2 g DHA:ta). Saadakseen 4,8 g w-3 FA:ta jokaisen liikalihavan potilaan on kulutettava 8 kapselia päivässä, jaettuna seuraavasti: 2 kapselia aamiaisella, 4 kapselia pääaterian yhteydessä ja 2 kapselia päivällisellä.

Opintojen suunnittelu. Jokainen osallistuja (vertailuhenkilöt ja lihavat potilaat) saa 2 pulloa (240 kapselia) kalaöljyä rekrytointihetkellä (aika 0), joka riittää kattamaan 1 kuukauden annoksen. Kun ensimmäinen kuukausi on kulunut, jäljellä olevat kapselit (jos niitä on) lasketaan ja 2 uutta pulloa lisäravinteita kattaa seuraavan kuukauden annos. Tämä strategia toistetaan kuukauden +2 lopussa kattamaan kuukauden +3 annos. Noudatetaan vähintään 1 kuukauden "pesuaikaa" (kuukausi +4). Kaikki kuvatut muuttujat (paitsi antropometria) analysoidaan aikoina 0, +2 ja +4.

Antropometria. Korkeutta metreinä (m), painoa kilogrammoina (kg) käytetään painoindeksin (BMI) laskemiseen kaavalla [paino (kg) / pituus (m)2]. Kehon koostumus määritetään sähköisellä bioimpedanssilla Full Body Composition Analyzer X-Contact 356:lla rasvamassan (% ja kg) ja rasvattoman (laiha) massan (% ja kg) kvantifioimiseksi. Antropometria tehdään vain ajankohtina 0 ja +4.

Verinäytteitä. Laskimoverta otetaan aikoina 0, +1, +2, +3 ja +4 antikoagulantilla (EDTA-K2) varustetulla Vacutainer-järjestelmällä. Alikvootti verta sentrifugoidaan plasman saamiseksi ja säilytetään -80 °C:ssa määritykseen asti. Perifeerisen veren mononukleaarisolut (PBMNC) saadaan tiheysgradienttisentrifugoinnilla (Lymphoprep). Näitä soluja käsitellään edelleen seuraavia määrityksiä varten: i) transkriptioanalyysi RNA-seq:llä ja qPCR:llä, ii) immuunisolupopulaatioiden (B, T ja monosyytit) virtaussytometrinen analyysi, iii) solu- ja energia-aineenvaihdunta (merihevonen) ja iv) "Treg-välitteinen soluproliferaation suppressio (TMSCP)" -määritys.

Biokemiallinen analyysi. Seuraavien metaboliittien, lipidien, sytokiinien ja adipokiinien seerumitasot määritetään: glukoosi, insuliini, kokonaiskolesteroli, HDL, LDL, triglyseridit, adipokiinit (leptiini, adiponektiini, IL-6, TNFalpha, MCP1) ja interleukiini (IL) 1beta 2, 4, 8, 10, 12, 17 ja TGFbeta. Rasvahappotasot määritetään kaasukromatografialla seeruminäytteistä ja erytrosyyttien ja leukosyyttien solukalvoista (PBMNC). SPM:n (resolviinit, protektiinit ja maresiinit) pitoisuus määritetään HPLC:llä, joka on kytketty massaspektrometriin.

PBMNC:n bioenergeettinen analyysi. Solujen aineenvaihdunta analysoidaan Seahorse XFe96 Analyzer -laitteella (Agilent) elävien solujen hapenkulutusnopeuden (OCR) ja solunulkoisen happamoitumisnopeuden (ECAR) mittaamiseksi 96-kuoppalevymuodossa. OCR ja ECAR ovat avainindikaattoreita mitokondrioiden hengityksestä ja vastaavasti glykolyysistä. Tästä energiankulutuksen analyysistä saadaan "bioenergeettinen terveysindeksi" (BHI). Tämä BHI heijastaa solujen käyttämää hallitsevaa energialähdettä ja voi heijastaa käytettyä aineenvaihduntareittiä. Jos esimerkiksi saadaan suuri määrä OCR:ää, tämä kuvastaa aerobista aineenvaihduntaa (rasvahappojen hapettuminen ja oksidatiivinen fosforylaatio, eli FAO ja OXPHOS), kun taas korkea ECAR osoittaa anaerobista aineenvaihduntaa ja glykolyysi on tärkein käytetty aineenvaihduntareitti.

Geeniekspression transkriptioanalyysi. Kokonais-RNA saadaan PBMNC:stä ja alapopulaatioista (eli monosyyteistä ja Treg-soluista) käyttämällä Trizol-reagenssia ja isopropanolisaostusta. RNA:n eheys määritetään 1-prosenttisissa agaroosigeeleissä elektroforeesilla ja sen konsentraatio UV-spektrofotometrialla 260 nm:ssä.

Sekvensointiin käytetään RNA-näytteitä, joiden RIN-arvot ovat 8 tai korkeammat; komplementaarinen DNA (cDNA) syntetisoidaan käänteistranskriptaasin ja (dT)15-oligonukleotidien kanssa. cDNA-fragmenttien päät liitetään sekvensointiadapteriin ja monistetaan PCR:llä RNA-Seq-kirjaston tuottamiseksi, joka on valmis sekvensointiin. Tässä tutkimuksessa käytetty sekvensointimenetelmä on seuraavan sukupolven sekvensointi (NGS) Illumina-alustalla. RNA-seq-analyysillä määritettyjen transkription tason muutosten validointi määritetään kvantitatiivisella reaaliaikaisella polymeraasiketjureaktiolla (qPCR) käyttämällä RotorGeneQ-lämpösyklilaitetta ja SybrGreenia leimana. 18S rRNA:ta käytetään taloudenhoitogeeninä.

Tehokkain RNA-Seq:n käyttö on erojen löytäminen geenien ilmentymisessä kahden tai useamman tilan välillä (esim. lihava vs. ei-lihava); tätä prosessia kutsutaan differentiaaliseksi ilmaisuksi. Tuotoksia kutsutaan usein differentiaalisesti ekspressoituneiksi geeneiksi (DEG), ja nämä geenit voivat olla joko ylös- tai alaspäin säädeltyjä (eli korkeampia tai alempana kiinnostuksen kohteena olevassa tilassa). 2-kertaisen eron rajapiste p-arvon kanssa