単核細胞のトランスクリプトミクスとオメガ3脂肪酸で治療された肥満患者の炎症状態

方法論研究のデザイン。 これは、前向き、実験的、比較的、非盲検 (オープン) 研究です。

性別を問わず、年齢 25 歳から 45 歳までの成人肥満 (BMI ≧ 35.0 kg/m2) 患者は、INCMNSZ の肥満外来クリニックから募集されます。 患者はインスリン抵抗性を持っている (または持っていない) かもしれませんが、次のいずれかであってはなりません: 2 型糖尿病 (制御されているかどうかに関係なく)、高血圧、肝不全または腎不全、メタボリック シンドローム、抗炎症薬または栄養補助食品の摂取、および場合妊娠中または授乳中の女性の。

対照群は、研究への参加を受け入れる性別を問わず、25 歳から 45 歳までの 40 人の健康な非肥満ボランティア (BMI 18.5 から 23.0 kg/m2) で構成されます。 このグループは最初 (時間 0) にのみ研究され、記載されているすべての変数の参照値を取得するために使用されるため、魚油サプリメントを消費しません.

魚油サプリメントは、オメガ-3 脂肪酸 (w-3 FA) の供給源となり、これは炎症研究財団 (IRF、マサチューセッツ州ボストン) からの寄付であり、120 カプセル/ボトルのマークのない密封されたボトルの形で提供されます.

各 1 グラムのカプセルには、0.6 g の w-3 FA (0.4 g の EPA と 0.2 g の DHA) が含まれています。 4.8 g の w-3 FA を提供するために、各肥満患者は次のように 1 日 8 カプセルを消費する必要があります: 朝食に 2 カプセル、主食に 4 カプセル、夕食に 2 カプセル

デザインを研究します。 各参加者 (対照被験者および肥満患者) は、募集時 (時間 0) に魚油を 2 本 (240 カプセル) 受け取ります。これは、1 か月分の投与量をカバーするのに十分です. 最初の 1 か月が経過した後、残りのカプセル (ある場合) がカウントされ、翌月の投与量をカバーするために 2 つの新しいサプリメントのボトルが提供されます。 この戦略は、+3 か月の投与量をカバーするために、+2 か月の終わりに繰り返されます。 少なくとも 1 か月の「ウォッシュ アウト」期間が観察されます (+4 か月)。 説明されているすべての変数 (人体測定を除く) は、時間 0、+2、および +4 で分析されます。

人体測定。 メートル単位の身長 (m)、キログラム単位の体重 (kg) を使用して、式 [体重 (kg)/身長 (m)2] でボディマス指数 (BMI) を計算します。 体組成は、全身組成アナライザー X-Contact 356 を使用した電気生体インピーダンスによって決定され、脂肪量 (% および kg) と無脂肪 (除脂肪) 量 (% および kg) が定量化されます。 人体測定は、時間 0 と +4 でのみ行われます。

血液サンプル。 0、+1、+2、+3、および +4 の時点で、抗凝固剤を含むバキュテナー システム (EDTA-K2) を使用して静脈血を採取します。 血液のアリコートを遠心分離して血漿を得、アッセイまで-80℃で保存します。 末梢血単核細胞（PBMNC）は、密度勾配遠心法（Lymphoprep）によって得られます。 これらの細胞は、次の決定のためにさらに処理されます: i) RNA-seq および qPCR による転写解析、ii) 免疫細胞集団 (B、T および単球) のフローサイトメトリー解析、iii) 細胞およびエネルギー代謝 (タツノオトシゴ)、および、 iv) 「細胞増殖の Treg を介した抑制 (TMSCP)」アッセイ。

生化学分析。 次の代謝産物、脂質、サイトカイン、およびアディポカインの血清レベルが決定されます: グルコース、インスリン、総コレステロール、HDL、LDL、トリグリセリド、アディポカイン (レプチン、アディポネクチン、IL-6、TNFalpha、MCP1)、およびインターロイキン (IL) 1beta 、2、4、8、10、12、17、および TGFbeta。 脂肪酸レベルは、血清サンプル、および赤血球と白血球の細胞膜 (PBMNC) のガスクロマトグラフィーによって決定されます。 SPM (レゾルビン、プロテクチン、およびマレシン) の濃度は、質量分析計に接続された HPLC によって決定されます。

PBMNCの生体エネルギー解析。 細胞代謝は、Seahorse XFe96 Analyzer (Agilent) を使用して分析し、96 ウェル プレート形式で生細胞の酸素消費率 (OCR) および細胞外酸性化率 (ECAR) を測定します。 OCR と ECAR 率は、それぞれミトコンドリア呼吸と解糖の重要な指標です。 このエネルギー消費の分析から、「生体エネルギー健康指数」（BHI）が得られます。 この BHI は、細胞が使用する主要なエネルギー源を反映し、使用される代謝経路を反映することができます。 たとえば、大量の OCR が得られた場合、これは好気性代謝 (脂肪酸の酸化と酸化的リン酸化、すなわち FAO と OXPHOS) を反映していますが、高い ECAR は嫌気性代謝を示し、使用される主な代謝経路は解糖です。

遺伝子発現の転写解析。 Trizol 試薬とイソプロパノール沈殿を使用して、PBMNC とサブポピュレーション (つまり、単球と Treg 細胞) から全 RNA を取得します。 ＲＮＡの完全性は、電気泳動により１％アガロースゲルで決定され、その濃度は２６０ｎｍでのＵＶ分光測光法により決定される。

RIN 値が 8 以上の RNA のサンプルは、シーケンスに使用されます。相補的 DNA (cDNA) は、逆転写酵素と (dT)15 オリゴヌクレオチドで合成されます。 cDNA フラグメントの末端は、シーケンシング アダプターに連結され、PCR によって増幅されて、シーケンシングの準備が整った RNA-Seq ライブラリが生成されます。 本研究で使用されるシーケンス方法は、イルミナ プラットフォームを使用した次世代シーケンス (NGS) になります。 RNA-seq 分析によって決定された転写レベルの変化の検証は、RotorGeneQ サーモサイクラーとラベルとして SybrGreen を使用した定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応 (qPCR) によって決定されます。 18S rRNA はハウスキーピング遺伝子として使用されます。

RNA-Seq の最も強力な用途は、2 つ以上の状態 (肥満と非肥満など) の間で遺伝子発現の違いを見つけることです。このプロセスは、差次的発現と呼ばれます。 出力はしばしば差次的に発現する遺伝子 (DEG) と呼ばれ、これらの遺伝子はアップレギュレーションまたはダウンレギュレートされる可能性があります (つまり、目的の状態でより高くまたは低くなります)。 p値との2倍差のカットオフポイント