Transkriptomi af mononukleære celler og inflammatorisk status hos overvægtige patienter behandlet med omega-3 fedtsyrer

Metode Undersøgelsesdesign. Dette er en prospektiv, eksperimentel, komparativ, ikke-blindet (åben) undersøgelse.

Voksne overvægtige (BMI ≥ 35,0 kg/m2) patienter i alderen 25 til 45 år, uanset køn, vil blive rekrutteret fra ambulatoriet for fedme på INCMNSZ. Patienterne kan have (eller ej) insulinresistens, men må ikke have nogen af ​​følgende: type 2-diabetes (kontrolleret eller ej), hypertension, lever- eller nyresvigt, metabolisk syndrom, tager antiinflammatoriske lægemidler eller kosttilskud, og i tilfælde af af kvinder, gravide eller ammende.

Kontrolgruppen vil bestå af 40 raske voksne ikke-overvægtige frivillige (BMI 18,5 til 23,0 kg/m2), i alderen 25 til 45 år, af ethvert køn, som accepterer at deltage i undersøgelsen. Denne gruppe vil kun blive undersøgt i begyndelsen (tidspunkt 0), og de vil ikke indtage fiskeolietilskuddet, da dets brug vil være at opnå referenceværdier for alle beskrevne variable.

Fiskeolietilskud vil være kilden til omega-3 fedtsyrer (w-3 FA), og dette vil være en donation fra Inflammation Research Foundation (IRF, Boston MA), i form af forseglede umærkede flasker med 120 kapsler/flaske.

Hver 1 gram kapsel indeholder 0,6 g w-3 FA (0,4 g EPA og 0,2 g DHA). For at give 4,8 g w-3 FA skal hver overvægtig patient indtage 8 kapsler/dag, fordelt som følger: 2 kapsler til morgenmad, 4 kapsler til hovedmåltidet og 2 kapsler til aftensmad.

Studere design. Hver deltager (kontrolpersoner og overvægtige patienter) vil modtage 2 flasker (240 kapsler) af fiskeolien på rekrutteringstidspunktet (tidspunkt 0), hvilket er nok til at dække doseringen i 1 måned. Efter den første måned er gået, vil de resterende kapsler (hvis nogen) blive talt, og 2 nye flasker med supplement vil blive leveret til at dække doseringen af ​​den følgende måned. Denne strategi vil blive gentaget i slutningen af ​​måned +2 for at dække doseringen af ​​måned +3. En "udvaskningsperiode" på mindst 1 måned vil blive observeret (måned +4). Alle variabler beskrevet (undtagen antropometri) vil blive analyseret på tidspunkterne 0, +2 og +4.

Antropometri. Højde i meter (m), vægt i kilogram (kg), vil blive brugt til at beregne body mass index (BMI) med formlen [vægt (kg)/ højde (m)2]. Kropssammensætning vil blive bestemt ved elektrisk bioimpedans med en Full Body Composition Analyzer X-Contact 356, for at kvantificere fedtmassen (i % og i kg) og den fedtfri (magre) masse (i % og kg). Antropometri vil kun blive udført på tidspunkterne 0 og +4.

Blodprøver. Venøst ​​blod vil blive opnået på tidspunkterne 0, +1, +2, +3 og +4 med Vacutainer-systemet med antikoagulant (EDTA-K2). En alikvot af blod vil blive centrifugeret for at opnå plasma og opbevaret ved -80°C indtil analyse. Perifere mononukleære blodceller (PBMNC) vil blive opnået ved tæthedsgradientcentrifugering (Lymphoprep). Disse celler vil blive behandlet yderligere til følgende bestemmelser: i) transkriptionel analyse ved RNA-seq og qPCR, ii) flowcytometrianalyse af immuncellepopulationer (B, T og monocytter), iii) cellulær og energimetabolisme (Seahorse) og, iv) "Treg-medieret undertrykkelse af cellulær proliferation (TMSCP)" assay.

Biokemisk analyse. Serumniveauer af følgende metabolitter, lipider, cytokiner og adipokiner vil blive bestemt: glucose, insulin, total kolesterol, HDL, LDL, triglycerider, adipokiner (leptin, adiponectin, IL-6, TNFalpha, MCP1) og interleukin (IL) 1beta , 2, 4, 8, 10, 12, 17 og TGFbeta. Fedtsyreniveauer vil blive bestemt ved gaskromatografi i serumprøver og i cellulære membraner fra erytrocytter og leukocytter (PBMNC). Koncentrationen af ​​SPM (resolviner, protectiner og maresins) vil blive bestemt ved HPLC koblet til et massespektrometer.

Bioenergetisk analyse af PBMNC. Cellulær metabolisme vil blive analyseret med en Seahorse XFe96 Analyzer (Agilent) for at måle iltforbrugshastighed (OCR) og ekstracellulær forsuringshastighed (ECAR) af levende celler i et 96-brønds pladeformat. OCR- og ECAR-frekvenser er nøgleindikatorer for henholdsvis mitokondriel respiration og glykolyse. Ud fra denne analyse af energiforbruget vil der blive opnået et "bioenergetisk sundhedsindeks" (BHI). Denne BHI afspejler den dominerende energikilde, der anvendes af cellerne, og kan afspejle den anvendte metaboliske vej. For eksempel, hvis en høj mængde OCR opnås, afspejler dette en aerob metabolisme (fedtsyreoxidation og oxidativ phosporylering, dvs. FAO og OXPHOS), hvorimod en høj ECAR indikerer anaerob metabolisme, og glykolyse er den vigtigste metaboliske vej, der anvendes.

Transskriptionel analyse af genekspression. Total RNA vil blive opnået fra PBMNC og subpopulationer (nemlig monocytter og Treg-celler) ved hjælp af Trizol-reagenset og isopropanol-udfældning. RNA-integritet vil blive bestemt i 1% agarosegeler ved elektroforese og dets koncentration ved UV-spektrofotometri ved 260 nm.

Prøver af RNA med RIN-værdier på 8 og højere vil blive brugt til sekventering; komplementært DNA (cDNA) vil blive syntetiseret med revers-transkriptase og (dT)15-oligonukleotider. Enderne af cDNA-fragmenterne vil blive ligeret til sekventeringsadaptere og amplificeret ved PCR for at producere RNA-Seq-biblioteket, som vil være klar til sekventering. Sekvenseringsmetoden, der bruges i denne undersøgelse, vil være næste generations sekventering (NGS) med Illumina-platformen. Validering af ændringer i niveauet af transkription bestemt ved RNA-seq analyse, vil blive bestemt ved kvantitativ real-time polymerase kædereaktion (qPCR) under anvendelse af en RotorGeneQ thermocycler og SybrGreen som mærke. 18S rRNA vil blive brugt som husholdningsgen.

Den mest kraftfulde brug af RNA-Seq er at finde forskelle i genekspression mellem to eller flere tilstande (f.eks. overvægtige vs ikke overvægtige); denne proces kaldes differentielt udtryk. Outputtene omtales ofte som differentielt udtrykte gener (DEG'er), og disse gener kan enten være op- eller nedregulerede (dvs. højere eller lavere i den aktuelle tilstand). Et skæringspunkt på 2 gange forskel med en p-værdi