Transkryptomika komórek jednojądrzastych i stan zapalny u pacjentów otyłych leczonych kwasami tłuszczowymi omega-3

Projekt badania metodologicznego. Jest to badanie prospektywne, eksperymentalne, porównawcze, bez zaślepienia (otwarte).

Dorośli pacjenci otyli (BMI ≥ 35,0 kg/m2) w wieku od 25 do 45 lat, dowolnej płci będą rekrutowani z Poradni Leczenia Otyłości INCMNSZ. Pacjenci mogą mieć (lub nie) insulinooporność, ale nie mogą mieć: cukrzycy typu 2 (kontrolowanej lub nie), nadciśnienia tętniczego, niewydolności wątroby lub nerek, zespołu metabolicznego, przyjmowania leków przeciwzapalnych lub suplementów diety, a w przypadku kobiet w ciąży lub karmiących.

Grupa kontrolna będzie się składać z 40 zdrowych, dorosłych, nieotyłych ochotników (BMI 18,5 do 23,0 kg/m2), w wieku od 25 do 45 lat, dowolnej płci, którzy wyrażą zgodę na udział w badaniu. Ta grupa będzie badana tylko na początku (czas 0) i nie będzie spożywać suplementu oleju rybnego, ponieważ jego zastosowanie będzie polegało na uzyskaniu wartości referencyjnych dla wszystkich opisanych zmiennych.

Suplement oleju rybiego będzie źródłem kwasów tłuszczowych omega-3 (w-3 FA) i będzie to darowizna od Inflammation Research Foundation (IRF, Boston MA), w postaci zapieczętowanych nieoznakowanych butelek po 120 kapsułek/butelkę.

Każda 1-gramowa kapsułka zawiera 0,6 g w-3 FA (0,4 g EPA i 0,2 g DHA). W celu dostarczenia 4,8 g w-3 FA każdy otyły pacjent musi spożywać 8 kapsułek dziennie, rozłożonych w następujący sposób: 2 kapsułki na śniadanie, 4 kapsułki z głównym posiłkiem i 2 kapsułki na kolację.

Projekt badania. Każdy uczestnik (grupa kontrolna i pacjenci otyli) otrzyma 2 butelki (240 kapsułek) oleju rybiego w momencie rekrutacji (czas 0), co wystarcza na pokrycie dawki na 1 miesiąc. Po upływie pierwszego miesiąca pozostałe kapsułki (jeśli są) zostaną przeliczone i zostaną dostarczone 2 nowe butelki suplementu, aby pokryć dawkę na kolejny miesiąc. Ta strategia zostanie powtórzona pod koniec miesiąca +2, aby pokryć dawkę z miesiąca +3. Obserwowany będzie okres „wymywania” trwający co najmniej 1 miesiąc (miesiąc +4). Wszystkie opisane zmienne (z wyjątkiem antropometrii) będą analizowane w czasach 0, +2 i +4.

Antropometria. Wzrost w metrach (m), waga w kilogramach (kg), posłuży do obliczenia wskaźnika masy ciała (BMI) ze wzoru [waga (kg)/wzrost (m)2]. Skład ciała zostanie określony za pomocą bioimpedancji elektrycznej za pomocą analizatora składu całego ciała X-Contact 356 w celu ilościowego określenia masy tłuszczowej (w % iw kg) oraz masy beztłuszczowej (w % iw kg). Antropometria będzie wykonywana tylko w czasach 0 i +4.

Próbki krwi. Krew żylna zostanie pobrana w czasach 0, +1, +2, +3 i +4 za pomocą systemu Vacutainer z antykoagulantem (EDTA-K2). Próbka krwi zostanie odwirowana w celu uzyskania osocza i będzie przechowywana w temperaturze -80°C do czasu wykonania testu. Komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMNC) zostaną uzyskane przez wirowanie w gradiencie gęstości (Lymhoprep). Komórki te będą dalej przetwarzane w celu przeprowadzenia następujących oznaczeń: i) analizy transkrypcji metodą RNA-seq i qPCR, ii) analizy cytometrii przepływowej populacji komórek odpornościowych (B, T i monocytów), iii) metabolizmu komórkowego i energetycznego (konik morski) oraz, iv) test „Supresja proliferacji komórkowej za pośrednictwem Treg (TMSCP)”.

Analiza biochemiczna. Oznaczone zostaną poziomy następujących metabolitów, lipidów, cytokin i adipokin w surowicy: glukoza, insulina, cholesterol całkowity, HDL, LDL, triglicerydy, adipokiny (leptyna, adiponektyna, IL-6, TNFalpha, MCP1) oraz interleukina (IL) 1beta , 2, 4, 8, 10, 12, 17 i TGFbeta. Poziomy kwasów tłuszczowych zostaną oznaczone metodą chromatografii gazowej w próbkach surowicy oraz w błonach komórkowych erytrocytów i leukocytów (PBMNC). Stężenie SPM (rezolwiny, protektyny i marezyny) zostanie określone metodą HPLC sprzężoną ze spektrometrem masowym.

Analiza bioenergetyczna PBMNC. Metabolizm komórkowy będzie analizowany za pomocą analizatora Seahorse XFe96 Analyzer (Agilent) w celu zmierzenia szybkości zużycia tlenu (OCR) i szybkości zakwaszenia pozakomórkowego (ECAR) żywych komórek w formacie 96-dołkowej płytki. Wskaźniki OCR i ECAR są kluczowymi wskaźnikami odpowiednio oddychania mitochondrialnego i glikolizy. Z tej analizy zużycia energii uzyskany zostanie „indeks zdrowia bioenergetycznego” (BHI). Ten BHI odzwierciedla dominujące źródło energii wykorzystywane przez komórki i może odzwierciedlać zastosowany szlak metaboliczny. Na przykład, jeśli uzyskuje się dużą ilość OCR, odzwierciedla to metabolizm tlenowy (utlenianie kwasów tłuszczowych i fosforylację oksydacyjną, tj. FAO i OXPHOS), podczas gdy wysoki ECAR wskazuje na metabolizm beztlenowy, a glikoliza jest głównym stosowanym szlakiem metabolicznym.

Transkrypcyjna analiza ekspresji genów. Całkowity RNA zostanie uzyskany z PBMNC i subpopulacji (tj. monocytów i komórek Treg) przy użyciu odczynnika Trizol i precypitacji izopropanolem. Integralność RNA zostanie określona w 1% żelu agarozowym metodą elektroforezy, a jego stężenie metodą spektrofotometrii UV przy 260 nm.

Próbki RNA o wartościach RIN 8 i wyższych zostaną użyte do sekwencjonowania; komplementarny DNA (cDNA) zostanie zsyntetyzowany za pomocą odwrotnej transkryptazy i (dT)15 oligonukleotydów. Końce fragmentów cDNA zostaną zligowane z adapterami sekwencjonowania i amplifikowane przez PCR w celu wytworzenia biblioteki RNA-Seq, która będzie gotowa do sekwencjonowania. Metodą sekwencjonowania zastosowaną w niniejszym badaniu będzie sekwencjonowanie nowej generacji (NGS) z platformą Illumina. Walidacja zmian w poziomie transkrypcji określona za pomocą analizy RNA-seq zostanie określona za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym (qPCR) z użyciem termocyklera RotorGeneQ i SybrGreen jako znacznika. 18S rRNA zostanie użyty jako gen metabolizmu podstawowego.

Najpotężniejszym zastosowaniem RNA-Seq jest znalezienie różnic w ekspresji genów między dwoma lub więcej stanami (np. Otyłość vs brak otyłości); ten proces nazywa się ekspresją różnicową. Wyjścia są często określane jako geny o zróżnicowanej ekspresji (DEG), a te geny mogą być regulowane w górę lub w dół (tj. Wyższe lub niższe w interesujących warunkach). Punkt odcięcia 2-krotnej różnicy z wartością p