Transcriptomics van mononucleaire cellen en ontstekingsstatus van zwaarlijvige patiënten behandeld met omega-3-vetzuren

Methodologie Onderzoeksopzet. Dit is een prospectieve, experimentele, vergelijkende, niet-geblindeerde (open) studie.

Volwassen patiënten met obesitas (BMI ≥ 35,0 kg/m2) in de leeftijd van 25 tot 45 jaar, ongeacht het geslacht, zullen worden geworven bij de polikliniek Obesitas van de INCMNSZ. De patiënten kunnen insulineresistentie hebben (of niet), maar mogen geen van de volgende symptomen hebben: diabetes type 2 (al dan niet onder controle), hypertensie, lever- of nierfalen, metabool syndroom, gebruik van ontstekingsremmende geneesmiddelen of voedingssupplementen, en in het geval van vrouwen, zwanger of zogend.

De controlegroep zal bestaan ​​uit 40 gezonde volwassen niet-zwaarlijvige vrijwilligers (BMI 18,5 tot 23,0 kg/m2), leeftijd 25 tot 45 jaar, van elk geslacht die accepteren om deel te nemen aan het onderzoek. Deze groep wordt alleen aan het begin bestudeerd (tijdstip 0) en ze zullen het visoliesupplement niet consumeren, aangezien het wordt gebruikt om referentiewaarden te verkrijgen voor alle beschreven variabelen.

Visoliesupplement zal de bron zijn van omega-3-vetzuren (w-3 FA) en dit zal een donatie zijn van de Inflammation Research Foundation (IRF, Boston MA), in de vorm van verzegelde ongemarkeerde flessen met 120 capsules/fles.

Elke capsule van 1 gram bevat 0,6 g w-3 FA (0,4 g EPA en 0,2 g DHA). Om 4,8 g w-3 FA te krijgen, moet elke zwaarlijvige patiënt 8 capsules per dag innemen, als volgt verdeeld: 2 capsules bij het ontbijt, 4 capsules bij de hoofdmaaltijd en 2 capsules bij het avondeten.

Studie ontwerp. Elke deelnemer (controleproefpersonen en zwaarlijvige patiënten) krijgt 2 flessen (240 capsules) van de visolie op het moment van werving (tijdstip 0), wat voldoende is om de dosering gedurende 1 maand te dekken. Nadat de eerste maand is verstreken, worden de resterende capsules (indien aanwezig) geteld en worden 2 nieuwe flessen supplement verstrekt om de dosering van de volgende maand te dekken. Deze strategie wordt aan het einde van maand +2 herhaald om de dosering van maand +3 te dekken. Er wordt een "wash-out"-periode van minimaal 1 maand in acht genomen (maand +4). Alle beschreven variabelen (behalve antropometrie) worden geanalyseerd op tijdstippen 0, +2 en +4.

Antropometrie. Lengte in meter (m), gewicht in kilogram (kg), wordt gebruikt om de body mass index (BMI) te berekenen met de formule [gewicht (kg)/ lengte (m)2]. De lichaamssamenstelling wordt bepaald door elektrische bio-impedantie met een Full Body Composition Analyzer X-Contact 356, om de vetmassa (in % en in kg) en de vetvrije (magere) massa (in % en kg) te kwantificeren. Antropometrie wordt alleen gedaan op tijden 0 en +4.

Bloedstalen. Veneus bloed wordt afgenomen op de tijdstippen 0, +1, +2, +3 en +4 met het Vacutainer systeem met antistollingsmiddel (EDTA-K2). Een deel van het bloed wordt gecentrifugeerd om plasma te verkrijgen en tot analyse bij -80°C bewaard. Perifere mononucleaire bloedcellen (PBMNC) zullen worden verkregen door dichtheidsgradiëntcentrifugatie (Lymphoprep). Deze cellen zullen verder worden verwerkt voor de volgende bepalingen: i) transcriptionele analyse door RNA-seq en qPCR, ii) flowcytometrie-analyse van immuuncelpopulaties (B, T en monocyten), iii) cellulair en energiemetabolisme (Seahorse) en, iv) de "Treg-gemedieerde onderdrukking van cellulaire proliferatie (TMSCP)"-assay.

Biochemische analyse. Serumniveaus van de volgende metabolieten, lipiden, cytokines en adipokines zullen worden bepaald: glucose, insuline, totaal cholesterol, HDL, LDL, triglyceriden, adipokines (leptine, adiponectine, IL-6, TNFalpha, MCP1) en interleukine (IL) 1beta , 2, 4, 8, 10, 12, 17 en TGFbeta. Vetzuurniveaus zullen worden bepaald door middel van gaschromatografie in serummonsters en in celmembranen van erytrocyten en leukocyten (PBMNC). De concentratie van SPM (resolvins, protectins en maresins) zal bepaald worden door middel van HPLC gekoppeld aan een massaspectrometer.

Bio-energetische analyse van PBMNC. Het cellulaire metabolisme zal worden geanalyseerd met een Seahorse XFe96 Analyzer (Agilent) om de zuurstofconsumptiesnelheid (OCR) en de extracellulaire verzuringssnelheid (ECAR) van levende cellen te meten in een plaat met 96 putjes. OCR- en ECAR-snelheden zijn belangrijke indicatoren van respectievelijk mitochondriale ademhaling en glycolyse. Uit deze analyse van het energieverbruik zal een "bio-energetische gezondheidsindex" (BHI) worden verkregen. Deze BHI weerspiegelt de dominante energiebron die door de cellen wordt gebruikt en kan de gebruikte metabole route weerspiegelen. Als bijvoorbeeld een grote hoeveelheid OCR wordt verkregen, weerspiegelt dit een aëroob metabolisme (vetzuuroxidatie en oxidatieve fosforylering, dwz FAO en OXPHOS), terwijl een hoge ECAR duidt op een anaëroob metabolisme en glycolyse is de belangrijkste gebruikte metabole route.

Transcriptionele analyse van genexpressie. Totaal RNA zal worden verkregen uit PBMNC en subpopulaties (namelijk monocyten en Treg-cellen) met behulp van het Trizol-reagens en isopropanolprecipitatie. RNA-integriteit zal worden bepaald in 1% agarosegels door elektroforese en de concentratie ervan door UV-spectrofotometrie bij 260 nm.

Monsters van RNA met RIN-waarden van 8 en hoger worden gebruikt voor sequencing; complementair DNA (cDNA) zal worden gesynthetiseerd met reverse-transcriptase en (dT)15-oligonucleotiden. De uiteinden van de cDNA-fragmenten zullen worden geligeerd aan sequentieadapters en geamplificeerd door PCR om de RNA-Seq-bibliotheek te produceren, die klaar zal zijn voor sequentiebepaling. De sequencing-methode die in de huidige studie wordt gebruikt, is next generation sequencing (NGS) met het Illumina-platform. Validatie van veranderingen in het transcriptieniveau bepaald door RNA-seq-analyse, zal worden bepaald door kwantitatieve real-time polymerasekettingreactie (qPCR) met behulp van een RotorGeneQ thermocycler en SybrGreen als label. 18S rRNA zal worden gebruikt als huishoudgen.

Het krachtigste gebruik van RNA-Seq is het vinden van verschillen in genexpressie tussen twee of meer aandoeningen (bijv. Zwaarlijvig versus niet zwaarlijvig); dit proces wordt differentiële expressie genoemd. De outputs worden vaak differentieel tot expressie gebrachte genen (DEG's) genoemd en deze genen kunnen omhoog of omlaag gereguleerd zijn (d.w.z. hoger of lager in de betreffende toestand). Een afkappunt van 2-voudig verschil met een p-waarde