Транскриптомика мононуклеарных клеток и воспалительного статуса у пациентов с ожирением, получавших омега-3 жирные кислоты

Методология Дизайн исследования. Это проспективное, экспериментальное, сравнительное, неслепое (открытое) исследование.

Взрослые пациенты с ожирением (ИМТ ≥ 35,0 кг/м2) в возрасте от 25 до 45 лет любого пола будут набраны из амбулаторной клиники ожирения INCMNSZ. Пациенты могут иметь (или не иметь) резистентность к инсулину, но не должны иметь ничего из следующего: сахарный диабет 2 типа (контролируемый или нет), гипертонию, печеночную или почечную недостаточность, метаболический синдром, прием противовоспалительных препаратов или пищевых добавок, а в случае женщин, беременных или кормящих.

Контрольная группа будет состоять из 40 здоровых взрослых добровольцев без ожирения (ИМТ от 18,5 до 23,0 кг/м2) в возрасте от 25 до 45 лет любого пола, которые согласились принять участие в исследовании. Эта группа будет изучаться только в начале (время 0), и они не будут потреблять добавку рыбьего жира, поскольку ее использование будет заключаться в получении контрольных значений для всех описанных переменных.

Добавка с рыбьим жиром будет источником омега-3 жирных кислот (w-3 FA), и это будет пожертвование от Фонда исследования воспалений (IRF, Бостон, Массачусетс) в виде запечатанных немаркированных бутылок по 120 капсул на бутылку.

Каждая 1-граммовая капсула содержит 0,6 г w-3 FA (0,4 г EPA и 0,2 г DHA). Для обеспечения 4,8 г w-3 FA каждый пациент с ожирением должен потреблять 8 капсул в день, распределяя их следующим образом: 2 капсулы на завтрак, 4 капсулы во время основного приема пищи и 2 капсулы на ужин.

Дизайн исследования. Каждый участник (контрольные субъекты и пациенты с ожирением) получит 2 флакона (240 капсул) рыбьего жира во время набора (время 0), чего достаточно для покрытия дозы на 1 месяц. По прошествии первого месяца оставшиеся капсулы (если они есть) будут подсчитаны, и будут предоставлены 2 новых флакона с добавкой для покрытия дозы на следующий месяц. Эта стратегия будет повторяться в конце месяца +2, чтобы покрыть дозу месяца +3. Будет наблюдаться период «вымывания» продолжительностью не менее 1 месяца (месяц +4). Все описанные переменные (кроме антропометрии) будут проанализированы в моменты времени 0, +2 и +4.

Антропометрия. Рост в метрах (м), вес в килограммах (кг) будут использоваться для расчета индекса массы тела (ИМТ) по формуле [вес (кг)/рост (м)2]. Состав тела будет определяться электрическим биоимпедансом с помощью анализатора состава всего тела X-Contact 356 для количественного определения массы жира (в % и в кг) и безжировой (тощей) массы (в % и в кг). Антропометрия будет производиться только в моменты времени 0 и +4.

Образцы крови. Венозная кровь будет получена в моменты времени 0, +1, +2, +3 и +4 с помощью системы Vacutainer с антикоагулянтом (ЭДТА-К2). Аликвоту крови центрифугируют для получения плазмы и хранят при температуре -80°C до анализа. Мононуклеарные клетки периферической крови (PBMNC) получают центрифугированием в градиенте плотности (Lymphoprep). Эти клетки будут дополнительно обработаны для следующих определений: i) анализ транскрипции с помощью секвенирования РНК и количественной ПЦР, ii) анализ проточной цитометрией популяций иммунных клеток (B, T и моноциты), iii) клеточный и энергетический метаболизм (морской конек) и, iv) анализ «Treg-опосредованное подавление клеточной пролиферации (TMSCP)».

Биохимический анализ. Будут определяться сывороточные уровни следующих метаболитов, липидов, цитокинов и адипокинов: глюкозы, инсулина, общего холестерина, ЛПВП, ЛПНП, триглицеридов, адипокинов (лептина, адипонектина, ИЛ-6, ФНО-альфа, МСР1) и интерлейкина (ИЛ) 1бета. , 2, 4, 8, 10, 12, 17 и TGFбета. Уровни жирных кислот будут определять с помощью газовой хроматографии в образцах сыворотки и в клеточных мембранах эритроцитов и лейкоцитов (PBMNC). Концентрацию SPM (резольвинов, протектинов и марезинов) определяют с помощью ВЭЖХ в сочетании с масс-спектрометром.

Биоэнергетический анализ PBMNC. Метаболизм клеток будет проанализирован с помощью анализатора Seahorse XFe96 (Agilent) для измерения скорости потребления кислорода (OCR) и скорости внеклеточного подкисления (ECAR) живых клеток в формате 96-луночного планшета. Показатели OCR и ECAR являются ключевыми индикаторами митохондриального дыхания и гликолиза соответственно. Из этого анализа потребления энергии будет получен «биоэнергетический индекс здоровья» (BHI). Этот BHI отражает доминирующий источник энергии, используемый клетками, и может отражать используемый метаболический путь. Например, если получено большое количество OCR, это отражает аэробный метаболизм (окисление жирных кислот и окислительное фосфорилирование, т.е. FAO и OXPHOS), тогда как высокое значение ECAR указывает на анаэробный метаболизм, а гликолиз является основным используемым метаболическим путем.

Транскрипционный анализ экспрессии генов. Полная РНК будет получена из PBMNC и субпопуляций (а именно, моноцитов и клеток Treg) с использованием реагента Trizol и осаждения изопропанолом. Целостность РНК будет определяться в 1% агарозных гелях с помощью электрофореза, а ее концентрация - с помощью УФ-спектрофотометрии при 260 нм.

Образцы РНК со значениями RIN 8 и выше будут использоваться для секвенирования; комплементарная ДНК (кДНК) будет синтезирована с помощью обратной транскриптазы и (dT)15 олигонуклеотидов. Концы фрагментов кДНК будут лигированы с адаптерами для секвенирования и амплифицированы с помощью ПЦР для получения библиотеки RNA-Seq, которая будет готова для секвенирования. Метод секвенирования, используемый в настоящем исследовании, будет секвенированием следующего поколения (NGS) с платформой Illumina. Подтверждение изменений уровня транскрипции, определяемых анализом РНК-seq, будет определяться количественной полимеразной цепной реакцией в реальном времени (qPCR) с использованием термоциклера RotorGeneQ и SybrGreen в качестве метки. 18S рРНК будет использоваться в качестве гена домашнего хозяйства.

Наиболее эффективным применением RNA-Seq является поиск различий в экспрессии генов между двумя или более состояниями (например, ожирением и отсутствием ожирения); этот процесс называется дифференциальным выражением. Выходы часто называют дифференциально экспрессируемыми генами (DEG), и эти гены могут регулироваться как вверх, так и вниз (т.е. выше или ниже в интересующем состоянии). Точка отсечки 2-кратной разницы со значением p