NAFLD 진단 및 예후의 바이오마커

프로젝트 설명:

현대사회에서는 산업발달로 인해 생활방식이 크게 변화하여 과식, 패스트푸드 섭취(당분과 지방이 풍부한 불균형한 식습관에 따름), 신체활동 감소 등 건강에 해로운 습관이 발생하고 있습니다. 유럽연합에서는 성인의 절반 이상이 과체중이거나 비만입니다. 이 그룹의 개인은 비알코올성 지방간 질환(NAFLD)과 같은 만성 간 질환이 발생할 위험이 높은 것으로 간주됩니다. 많은 역학 보고서는 NAFLD의 발병을 잘못된 식습관 선택 및 좌식 습관과 연관시켰습니다. 현재 효과적인 약리학적 치료법은 없으며, 질병을 예방하거나 개선할 수 있는 유일한 방법은 보다 건강한 생활 방식(맞춤형 식단, 신체 활동, 인지 행동 심리 치료)을 선도하는 것입니다. 이 솔루션의 주요 제한점은 치료에 대한 환자 적응력이 부족하다는 것입니다.

NAFLD는 단순 지방증부터 비알코올성 지방간염(NASH)까지 광범위한 조직학적 스펙트럼을 포괄합니다. NASH는 염증을 동반한 지방증을 특징으로 하며 섬유증이 없는 상태부터 간경변까지 다양한 단계의 섬유증을 나타낼 수 있습니다. 섬유증 단계의 진단 및 평가를 위한 최적의 기준은 여전히 ​​간 생검입니다. 그러나 NAFLD가 의심되는 모든 환자에 대해 간 생검을 수행하는 것은 윤리적인 이유와 유효한 선별 방법이 아니기 때문에 불가능합니다. 따라서 비침습적인 선별검사 및 진단 방법의 개발이 필요하다. 또한, 조기 진단은 환자의 만성 질환에 대한 인식을 높이고 생활 방식을 바꾸도록 동기를 부여할 수 있습니다.

따라서 이를 고려하여 선별검사 및 진단을 위한 비침습적 방법을 개발하는 것이 필요합니다. 더욱이, 조기 진단은 환자의 만성 질환에 대한 인식을 높이고 생활 방식을 바꾸도록 설득할 수 있습니다.

새로운 마커를 식별하는 것은 다음과 같은 이유로 매우 어려운 작업이 될 수 있다는 점을 고려해야 합니다.

생리병리학의 복잡성. 질병 진행에 관여하는 여러 요인. 다른 많은 섬유성 질환에 공통 매개체가 존재합니다. 따라서 새로운 바이오마커를 발견하기 위한 독창적인 전략이 근본적으로 중요합니다. 처리량이 많은 기술의 발전 덕분에 오늘날 엄청난 양의 게놈 및 단백질 데이터를 온라인 데이터베이스에서 쉽게 접근할 수 있습니다. 따라서 Cytoscape와 같은 오픈 소스 소프트웨어를 사용하여 상호 작용(세포 내 단백질-단백질 상호 작용 -PPI-)을 연구하는 것이 가능합니다. 이러한 방식으로 생물정보학을 사용하면 in silico 생물학적 네트워크 데이터를 분석할 수 있으며, 이는 값비싼 장비 없이도 임상적으로 관심 있는 바이오마커를 식별하는 방법을 나타냅니다.

목적:

이 프로젝트의 목적은 비침습적 임상 테스트에 사용할 수 있는 NAFLD의 진단 및 예후에 유용한 새로운 바이오마커를 식별(in silico 분석을 통해)하고 검증하는 것입니다.

후보 바이오마커를 식별하는 우리의 초기 접근 방식은 in silico 연구에서 다음 작업 기준을 사용하는 것이었습니다.

1. 국제 분자 교환(IMEx) 컨소시엄의 지침을 준수하는 데이터베이스에서 PPI 데이터를 얻습니다.
2. 표 1에 나열된 단백질에 대한 생물학적 네트워크를 구축합니다(최근 과학 저널에서 NAFLD 진단을 위한 후보로 제안됨).
3. 근섬유아세포 표현형의 활성화/복귀를 나타내는 간 성상세포(HSC)에서 방출되는 단백질에 대한 생물학적 네트워크를 구축합니다(HSC는 간 섬유증과 관련된 주요 세포입니다). 표 1을 참조하세요.
4. 우리 연구에는 HSC 활성화의 알려진 마커(α-평활근 액틴, α-SMA)와 세포외 기질(ECM)의 필수 구성 요소인 콜라겐 알파-III 유형 I(Col3A1)이 포함됩니다.
5. 관심 있는 단백질, 즉 혈청에서 방출되고 가장 많은 수의 생물학적 네트워크를 연결하는 단백질을 선택하십시오.

표 1 - 문헌에 기술된 후보 바이오마커 단백질 관련 정보 국소화 사이토케라틴-18(CK-18) 간세포 세포사멸의 지표. NAFLD 세포질, 핵 지방세포 지방산 결합 단백질(AFABP)의 바이오마커로 제안 NAFLD 세포질의 바이오마커로 보고 섬유아세포 성장인자 21(FGF21) 지방증 정도와 상관관계가 있는 간 및 혈청 발현 증가 인슐린 유사 성장 방출 인자 결합 단백질 3(IGFBP-3) 최근 혈청 단백질체 연구에서 NAFLD의 바이오마커로 제안됨 분비된 림프구 세포질 단백질 1(LCP1) NAFLD의 바이오마커로 제안된 액틴 결합 단백질 세포질, 막 갈렉틴-1(LGALS1) 활성화된 HSC에서 발현 증가 분비된 유비퀴틴 접합 인자 E4B(UBE4B) 활성화된 HSC에서 발현 증가 세포질, 분비된 비트로넥틴(VTN) 비활성화된 HSC에서 발현 증가 분비된 오스테오폰틴(OPN) ECM의 구성성분 분비된 라미닌 서브유닛 베타 1(LAMB1)에서 발현 감소 비활성화된 HSC 분비된 α-SMA 활성화된 HSC에서 발현 증가 세포질 Col3A1 섬유발생(세포외 기질의 구성 요소) 생산 증가 분비

설명된 작업 기준을 기반으로 Cytoscape를 사용하여 표 1의 단백질(12개 생물학적 네트워크)에 대해 생성된 각 PPI 네트워크가 공통 상호 작용 단백질(공통 파트너)을 통해 연결된 통합 생물학적 네트워크(그림 1)를 얻었습니다. 이러한 일반적인 단백질, 특히 세포에서 방출되는 단백질(가용성 인자)이 우리의 표적 단백질이 될 것입니다.

예비 분석을 통해 우리는 IGF-2(인슐린 유사 성장 인자 2), SPARC(시스테인이 풍부한 산성 분비 단백질), EPICAN 및 EGFR(표피 성장 인자 수용체)(강조 표시됨)과 같은 단백질을 잠재적인 바이오마커로 확인했습니다. 그림 1에서 빨간색으로 표시).

실험 계획

연구 활동은 이탈리아 간 재단(Italian Liver Foundation)에서 진행됩니다. 샘플 수집은 Cattinara 병원의 일반외과에서 실시됩니다.

설명된 목표를 달성하기 위해 일반외과의 비만 수술 후보자 그룹이 참여할 것입니다. 진료 방문이 예정되어 있으며, 이 기간 동안 일반적인 임상 정보를 수집하고 체중, 키, 허리둘레, 혈압을 측정합니다. 일상적인 수술 전 준비 및 외래 추적 관찰의 일환으로 일반 혈액학적 및 생화학적 매개변수(전체 혈구수, 포도당, 인슐린, 중성지방, 총 콜레스테롤, HDL, 트랜스페린, 페리틴, 혈청 철, C 반응성 단백질), 간 기능(아미나제, 알부민, 총 단백질) 및 신장 기능(크레아티닌, 요중 크레아티닌, 미세알부민뇨증)은 혈장/혈청 샘플에 대한 일반적인 실험실 테스트를 통해 평가됩니다. 수집된 샘플의 추가 분취량은 RNA 및 단백질 추출과 후속 샘플 품질 평가에 사용됩니다. 진단 조사 및 수술 전 평가를 위해 일상적으로 수행되는 혈액 채취를 수행할 때 천자 부위의 일시적인 통증과 멍(혈종)의 출현, 혈액 수집 시 발생할 수 있는 합병증이 포함될 수 있습니다.

또한, 수술 전 간탄성측정을 시행하여 방사선학적 결과와 실험실 결과를 비교할 예정입니다. 이는 초음파와 유사한 비침습적 검사입니다. 이러한 조사는 수술 후 1년 후에 반복되어 예상되는 개선 정도를 정량화하며, 혈액 채취만 6개월 후에 반복됩니다. 두 수술 모두 일반외과에서 담당합니다.

SICOB의 국가 가이드라인에 따라 비만이 예정된 비만수술 시에는 피하조직, 간조직, 내장지방 조직검사를 실시하게 된다. 이러한 생검은 수술 시간을 크게 연장하지 않습니다. 이 세 가지 샘플에서 연구된 마커의 존재와 양이 확인됩니다. 또한 간 생검의 일부는 섬유화 및 지방증의 정도를 연구하기 위한 최종 조직학적 검사를 위해 병리과로 보내집니다. 본 연구를 위해 수집 및 보존된 샘플은 환자의 건강 상태를 모니터링하는 데 사용됩니다. 또한 본 연구 결과는 비알코올성 지방간 질환의 치료 및 예방 개선에 기여함으로써 다른 환자들에게도 도움이 될 수 있을 것이다.

수술 예정인 환자에게는 수술 전에 앞서 언급한 절차, 위험 및 이점이 설명된 사전 동의서를 제공하고 설명합니다.

실험 계획은 세 단계로 나눌 수 있습니다.

1단계: 심층적인 실리코 연구. 예상 시간: 1개월.

2단계: 생체 내 연구, 샘플 수집(혈액 및 간), 샘플 은행. 각 환자에 대한 임상 및 실험실 데이터 수집.

RNA와 단백질을 추출한 후 시료 품질을 평가합니다. 바이오마커 패널에 대한 mRNA 발현의 정량화(표 1 + 잠재적 바이오마커).

ELISA/웨스턴 블롯을 사용한 후보 바이오마커의 혈청 및 조직(간) 정량화.

예상 시간: 9개월.

3단계: 결과 검증:

얻은 결과는 Cattinara 병원에서 사용할 수 있는 임상 분석 데이터(혈액 수치), 간 생검 데이터(조직병리학 데이터) 및 사용 가능한 영상 기술(초음파, 탄성 검사)과 상호 연관됩니다. 새로운 바이오마커를 질병의 단계와 연관시키기 위해 통계적 분석이 수행될 것입니다.

예상 시간: 2개월.

그림 1: 인실리코 연구.

표본 크기 및 통계 분석:

입원환자와 외래환자 모두 총 62명의 환자가 연구에 등록될 예정입니다. 표본 크기를 계산하는 기본 방정식은 다음과 같습니다.

N = (2 x (Zα + Zβ)2 x S2) / d2

N = 각 샘플 그룹의 필수 과목. 우리는 그룹 A(경증 섬유증 유무, 브런트: 0-1)와 그룹 B(중등도 내지 중증 섬유증, 브런트: 2-3)의 두 그룹을 설정했습니다.

Zα = 원하는 위험에 대한 Z 값(우리의 경우 양측 테스트의 경우 1.96입니다). Zβ = 원하는 위험에 대한 Z 값(우리의 경우 양측 테스트의 경우 1.282입니다). S2 = 대조군 또는 참조 그룹에 대한 정량적 매개변수의 분산 또는 분산(우리의 경우 참조 그룹: 그룹 A, 분산 값 = 150 U/L).

d = 감지 가능한 차이의 최소값(우리의 경우 200U/L).

이 절차를 사용하여 계산된 각 그룹의 표본 크기는 29.3입니다. 5%에서 샘플 손실 가능성에 대한 보정을 추가하면 총 30.87이 생성됩니다. 총 샘플 수는 62개입니다. 우리는 이 분석을 연구에서 가장 많이 보고된 마커 중 하나(CK-18)에 적용했습니다. 우리의 연구에는 4가지 바이오마커 연구가 포함되어 있으므로 마커 패널을 사용하여 연구 결과의 가능성을 높일 수 있습니다(필요한 샘플 수를 잠재적으로 줄일 수 있음).

연구의 유용성:

NAFLD와 같은 만성 간질환 분야에서는 진단 및 임상적 예후를 위한 비침습적 기술의 식별 및 개발이 시급히 필요합니다. 이러한 방법은 더 빠른 임상 의사 결정으로 이어져 환자와 의료진 모두에게 도움이 될 것입니다. 따라서 본 연구에서 얻은 결과는 NAFLD의 진단, 스크리닝 및 치료를 개선하기 위한 새로운 혈청 바이오마커의 식별 및 검증에 기여하는 것을 목표로 합니다. 또한, 검증된 바이오마커가 염증 및 섬유화와 함께 진행되는 다른 간질환의 예후 지표로도 활용될 수 있을 것으로 기대된다. 비침습적 바이오마커의 가용성은 섬유증 진행률이 높은 개인과 비증식 단계에 남아 있거나 완화에 도달할 수 있는 개인을 구별하여 임상 실습에 즉각적인 영향을 미칠 것입니다. 이 정보는 보다 정확한 치료법 선택과 효능에 기여하여 전반적인 환자 결과를 향상시킵니다. 또한, 우리 기관의 생물학적 샘플 은행의 존재와 함께 특정 바이오마커의 식별은 이 상태뿐만 아니라 간의 다른 섬유화 과정과 관련된 분자 과정을 철저히 연구할 수 있는 가능성을 제공합니다. 새로운 약리학적 표적을 식별합니다.

제안된 연구의 관찰 특성을 고려할 때, 일반적인 임상 실습을 위해 이미 제공된 것 외에 추가 보험 정책은 필요하지 않습니다.