Биомаркеры в диагностике и прогнозе НАЖБП

Описание Проекта:

В современном обществе с приходом индустриального развития образ жизни сильно изменился, что привело к появлению таких нездоровых привычек, как переедание и употребление фаст-фуда (после несбалансированной диеты, богатой сахарами и жирами) и снижение физической активности. В Европейском Союзе более половины взрослых имеют избыточный вес или страдают ожирением. Эта группа лиц считается подверженной высокому риску развития хронических заболеваний печени, таких как неалкогольная жировая болезнь печени (НАЖБП). Многие эпидемиологические отчеты связывают возникновение НАЖБП с неправильным выбором диеты и малоподвижным образом жизни. В настоящее время не существует эффективных фармакологических методов лечения, и единственный способ предотвратить или улучшить это состояние — вести более здоровый образ жизни (индивидуальная диета, физическая активность и когнитивно-поведенческая психологическая терапия). Основным ограничением этого решения является отсутствие адаптивности пациента к терапии.

НАЖБП охватывает широкий гистологический спектр: от простого стеатоза до неалкогольного стеатогепатита (НАСГ). НАСГ характеризуется стеатозом с воспалением и может представлять собой различные стадии фиброза, от отсутствия до цирроза. Золотым стандартом диагностики и оценки стадии фиброза остается биопсия печени. Однако выполнение биопсии печени у каждого пациента с подозрением на НАЖБП невозможно как по этическим соображениям, так и потому, что это недействительный метод скрининга. Поэтому необходима разработка неинвазивных методов скрининга и диагностики. Кроме того, ранняя диагностика может повысить осведомленность пациентов о своем хроническом заболевании и побудить их изменить свой образ жизни.

Учитывая это, необходимо разработать неинвазивные методы скрининга и диагностики. Более того, ранняя диагностика может повысить осведомленность пациента о своем хроническом заболевании и убедить его изменить свой образ жизни.

Следует учитывать, что идентификация новых маркеров может оказаться весьма сложной задачей из-за:

Сложность физиопатологии. Множество факторов, участвующих в прогрессировании заболевания. Наличие общих медиаторов при многих других фиброзных заболеваниях. Поэтому оригинальная стратегия, направленная на обнаружение новых биомаркеров, имеет принципиальное значение. Благодаря развитию высокопроизводительных технологий сегодня огромное количество геномных и протеомных данных легко доступно в онлайн-базах данных. Таким образом, можно изучать интерактом (белково-белковые взаимодействия -PPI- внутри клетки) с помощью программного обеспечения с открытым исходным кодом, такого как Cytoscape. Таким образом, использование биоинформатики позволяет нам анализировать in silico данные биологической сети, что представляет собой способ идентификации биомаркеров, представляющих клинический интерес, без необходимости использования дорогостоящего оборудования.

Цель:

Целью этого проекта является выявление (посредством анализа in silico) и валидация новых биомаркеров, полезных для диагностики и прогноза НАЖБП, которые можно использовать в неинвазивных клинических тестах.

Наш первоначальный подход к выявлению биомаркеров-кандидатов заключался в использовании следующих рабочих критериев в исследованиях in silico:

1. Получите данные PPI из баз данных, которые соответствуют рекомендациям консорциума Международного молекулярного обмена (IMEx).
2. Постройте биологические сети для белков, перечисленных в таблице 1 (которые были предложены в качестве кандидатов для диагностики НАЖБП в недавних научных журналах).
3. Создайте биологические сети для белков, высвобождаемых звездчатыми клетками печени (ЗКП), которые указывают на активацию/реверсию миофибробластического фенотипа (ЗКП являются основными клетками, участвующими в фиброзе печени). См. Таблицу 1.
4. Включите в наши исследования известный маркер активации ГСК (α-актин гладких мышц, α-SMA) и важнейший компонент внеклеточного матрикса (ECM): коллаген альфа-III типа I (Col3A1).
5. Выберите интересующие белки, то есть те, которые выделяются в сыворотке и соединяют наибольшее количество биологических сетей.

Таблица 1. Биомаркеры-кандидаты, описанные в литературе Белок Соответствующая информация Локализация Цитокератин-18 (СК-18) Индикатор гепатоцеллюлярного апоптоза. Предлагается в качестве биомаркера при НАЖБП. Цитоплазма, ядро. Белок, связывающий жирные кислоты адипоцитов (AFABP). Сообщается как биомаркер при НАЖБП. Цитоплазма. Фактор роста фибробластов 21 (FGF21). Повышенная экспрессия в печени и сыворотке, коррелирует со степенью стеатоза. Высвобождается инсулиноподобный рост. фактор-связывающий белок 3 (IGFBP-3) Предлагается в качестве биомаркера НАЖБП в недавнем исследовании протеома сыворотки. Секретируемый цитозольный белок 1 лимфоцитов (LCP1) Актин-связывающий белок, предложенный в качестве биомаркера НАЖБП Цитоплазма, мембрана Галектин-1 (LGALS1) Повышенная экспрессия в активированных ЗКП Секретируемый фактор конъюгации убиквитина E4B (UBE4B) Повышенная экспрессия в активированных ЗКП Цитоплазма, секретируемая Витронектин (VTN) Повышенная экспрессия в инактивированных ЗКП Секретируемый остеопонтин (OPN) Компонент ВКМ Секретируемая субъединица бета 1 ламинина (LAMB1) Снижение экспрессии в активированных ЗКП инактивированные ЗКП Секретируемые α-SMA Повышенная экспрессия в активированных ЗКП Цитоплазма Col3A1 Увеличение продукции при фиброгенезе (компонент внеклеточного матрикса) Секретируемые

На основе описанных рабочих критериев и с помощью Cytoscape мы получили интегрированную биологическую сеть (рис. 1), где каждая из сетей PPI, созданных для белков в таблице 1 (12 биологических сетей), была связана через общие белки взаимодействия (общие партнеры). Эти общие белки, особенно те, которые выделяются клетками (растворимые факторы), будут нашими целевыми белками.

В результате нашего предварительного анализа мы определили следующие белки как потенциальные биомаркеры: IGF-2 (инсулиноподобный фактор роста 2), SPARC (секретируемый белок, кислый и богатый цистеином), EPICAN и EGFR (рецептор эпидермального фактора роста) (выделены красным на рисунке 1).

Экспериментальный план

Исследовательская деятельность будет проводиться в Итальянском фонде печени. Сбор образцов будет проходить в отделении общей хирургии больницы Каттинара.

Для достижения описанных целей будут привлечены группы пациентов-кандидатов на бариатрическую операцию отделения общей хирургии. Назначается визит к врачу, во время которого будет собрана общая клиническая информация, измерены вес, рост, окружность талии и артериальное давление. В рамках плановой предоперационной подготовки и амбулаторного наблюдения определяют общие гематологические и биохимические показатели (общий анализ крови, глюкоза, инсулин, триглицериды, общий холестерин, ЛПВП, трансферрин, ферритин, сывороточное железо, С-реактивный белок), печень. функция (трансаминазы, альбумин, общий белок) и функция почек (креатинин, креатинин мочи, микроальбуминурия) будут оцениваться с помощью обычных лабораторных тестов на образцах плазмы/сыворотки. Дополнительная аликвота собранных образцов будет использована для экстракции РНК и белка и последующей оценки качества образцов. Забор крови, который обычно проводится для диагностических исследований и предоперационной оценки, может сопровождаться кратковременной болью в месте прокола и появлением синяка (гематомы) — осложнений, которые могут возникнуть при любом взятии крови.

Кроме того, перед операцией будет проведена эластометрия печени, что позволит сравнить рентгенологические результаты с лабораторными. Это неинвазивное обследование, похожее на УЗИ. Эти исследования будут повторены через год после операции для количественной оценки ожидаемых улучшений, а через шесть месяцев будет повторен только забор крови. Обе процедуры будут осуществляться отделением общей хирургии.

Во время бариатрической операции, которая назначается при ожирении в соответствии с национальными рекомендациями SICOB, будут проводиться биопсии подкожного, печеночного и висцерального жира. Эти биопсии существенно не продлевают время хирургического вмешательства. В этих трех образцах будет проверено наличие и количество изучаемых маркеров. Дополнительно часть биоптата печени будет отправлена ​​в отделение патологии для окончательного гистологического исследования для изучения степени фиброза и стеатоза. Собранные и сохраненные для этого исследования образцы будут использоваться для мониторинга состояния здоровья пациента. Кроме того, результаты этого исследования могут быть полезны другим пациентам, способствуя улучшению лечения и профилактики неалкогольной жировой болезни печени.

Пациенту, которому назначена операция, перед процедурой будет предоставлена ​​и объяснена форма информированного согласия, в которой будут описаны вышеупомянутые процедуры, риски и преимущества.

План эксперимента можно разделить на три этапа:

Этап 1: Углубленные исследования в silico. Ориентировочное время: 1 месяц.

Этап 2: Исследования in vivo, сбор образцов (крови и печени), банк образцов. Сбор клинических и лабораторных данных по каждому пациенту.

Экстракция РНК и белков с последующей оценкой качества образцов. Количественная оценка экспрессии мРНК для панели биомаркеров (Таблица 1 + потенциальные биомаркеры).

Количественное определение потенциальных биомаркеров в сыворотке и тканях (печени) с использованием ELISA/Western blot.

Ориентировочное время: 9 месяцев.

Этап 3: Проверка результатов:

Полученные результаты будут сопоставлены с клинико-аналитическими данными (показатели крови), данными биопсии печени (гистопатологические данные) и доступными методами визуализации (УЗИ, эластография) в больнице Каттинара. Будет проведен статистический анализ, чтобы соотнести новые биомаркеры со стадией заболевания.

Ориентировочное время: 2 месяца.

Рисунок 1: Исследования in silico.

Размер выборки и статистический анализ:

В исследование планируется включить 62 пациента, как стационарных, так и амбулаторных. Основное уравнение для расчета размера выборки выглядит следующим образом:

N = (2 х (Zα + Zβ)2 х S2)/d2

N = необходимые субъекты в каждой выборочной группе. Мы выделили две группы: группа А (без фиброза или с легким фиброзом, Брант: 0-1) и группа Б (фиброз от умеренной до тяжелой степени, Брант: 2-3).

Zα = значение Z для желаемого риска (для нас оно равно 1,96 для двустороннего теста). Zβ = значение Z для желаемого риска (для нас оно составляет 1,282 для двустороннего теста). S2 = Дисперсия или дисперсия количественного параметра для контрольной или контрольной группы (для нас контрольная группа: Группа А, значение дисперсии = 150 Ед/л).

d = Минимальное значение обнаруживаемой разницы (для нас 200 Ед/л).

Рассчитанный размер выборки для каждой группы с использованием этой процедуры составляет 29,3. Добавление поправки на возможность потери выборки на уровне 5% дает в общей сложности 30,87. Общее количество образцов — 62. Мы применили этот анализ к одному из маркеров исследования (CK-18), поскольку о нем чаще всего сообщается в литературе. Поскольку наше исследование предполагает изучение 4-х биомаркеров, возможно, работа с панелью маркеров повысит вероятность получения результатов исследования (потенциально сократив необходимое количество образцов).

Полезность исследования:

В области хронических заболеваний печени, таких как НАЖБП, существует острая необходимость выявления и разработки неинвазивных методов диагностики и клинического прогноза. Эти методы приведут к более быстрому принятию клинических решений, что принесет пользу как пациентам, так и медицинскому персоналу. Таким образом, результаты, полученные в этом исследовании, призваны внести вклад в идентификацию и проверку новых сывороточных биомаркеров для улучшения диагностики, скрининга и лечения НАЖБП. Кроме того, есть надежда, что проверенные биомаркеры также можно будет использовать в качестве прогностических маркеров при других заболеваниях печени, которые прогрессируют с воспалением и фиброзом. Доступность неинвазивных биомаркеров окажет немедленное влияние на клиническую практику, позволяя различать людей с высокой скоростью прогрессирования фиброза и тех, кто может оставаться в непролиферативной фазе или даже достичь ремиссии. Эта информация будет способствовать более точному выбору и эффективности терапии, тем самым улучшая общий результат лечения пациентов. Кроме того, идентификация специфических биомаркеров, а также наличие банка биологических образцов в нашем учреждении дает возможность тщательно изучить молекулярные процессы, участвующие не только в этом состоянии, но и в других фиброгенных процессах в печени, с возможностью выявление новых фармакологических мишеней.

Учитывая наблюдательный характер предлагаемого исследования, не требуется никаких дополнительных страховых полисов, кроме тех, которые уже предусмотрены для обычной клинической практики.