Biomarcatori nella diagnosi e nella prognosi della NAFLD

Descrizione del progetto:

Nella società moderna, con l'avvento dello sviluppo industriale, lo stile di vita è stato notevolmente modificato, portando ad abitudini poco salutari come l'eccesso di cibo e il consumo di fast food (a seguito di una dieta squilibrata e ricca di zuccheri e grassi) e la ridotta attività fisica. Nell’Unione Europea, oltre la metà degli adulti sono in sovrappeso o obesi. Questo gruppo di individui è considerato ad alto rischio per lo sviluppo di malattie epatiche croniche come la steatosi epatica non alcolica (NAFLD). Molti rapporti epidemiologici hanno collegato l’insorgenza della NAFLD a scelte alimentari sbagliate e ad abitudini sedentarie. Attualmente non esistono terapie farmacologiche efficaci e l’unico modo per prevenire o migliorare la condizione è condurre uno stile di vita più sano (diete personalizzate, attività fisica e terapie psicologiche cognitivo-comportamentali). Il limite principale di questa soluzione è la mancanza di adattabilità del paziente alla terapia.

La NAFLD comprende un ampio spettro istologico che va dalla semplice steatosi alla steatoepatite non alcolica (NASH). La NASH è caratterizzata da steatosi con infiammazione e può presentare diversi stadi di fibrosi, da assente a cirrosi. Il gold standard per la diagnosi e la valutazione dello stadio della fibrosi rimane la biopsia epatica. Tuttavia, eseguire una biopsia epatica per ogni paziente sospetto di NAFLD è impossibile, sia per ragioni etiche sia perché non è un metodo di screening valido. Pertanto, è necessario sviluppare metodi non invasivi per lo screening e la diagnosi. Inoltre, la diagnosi precoce potrebbe aumentare la consapevolezza dei pazienti riguardo alla propria malattia cronica e motivarli a cambiare il proprio stile di vita.

Considerando ciò, è quindi necessario sviluppare metodi non invasivi per lo screening e la diagnosi. Inoltre, la diagnosi precoce potrebbe aumentare la consapevolezza del paziente riguardo alla propria condizione cronica e convincerlo a cambiare il proprio stile di vita.

Va considerato che l’identificazione di nuovi marcatori può essere un compito molto impegnativo a causa:

Complessità della fisiopatologia. Molteplici fattori coinvolti nella progressione della malattia. Presenza di mediatori comuni in molti altri disturbi fibrotici. Pertanto, una strategia originale volta alla scoperta di nuovi biomarcatori è di fondamentale importanza. Grazie allo sviluppo di tecnologie ad alto rendimento, oggigiorno un’enorme quantità di dati genomici e proteomici è facilmente accessibile nei database online. È così possibile studiare l'interattoma (interazioni proteina-proteina -PPI- all'interno di una cellula) utilizzando software open source come Cytoscape. In questo modo, l'uso della bioinformatica ci consente di analizzare i dati della rete biologica in silico, che rappresenta un modo per identificare biomarcatori di interesse clinico senza la necessità di apparecchiature costose.

Obbiettivo:

Lo scopo di questo progetto è identificare (attraverso analisi in silico) e validare nuovi biomarcatori utili per la diagnosi e la prognosi della NAFLD, che possano essere utilizzati in test clinici non invasivi.

Il nostro approccio iniziale nell'identificazione dei biomarcatori candidati consisteva nell'utilizzare i seguenti criteri di lavoro negli studi in silico:

1. Ottenere dati PPI da database che aderiscono alle linee guida del consorzio International Molecular Exchange (IMEx).
2. Costruire reti biologiche per le proteine ​​elencate nella tabella 1 (che sono state proposte come candidate per la diagnosi di NAFLD in recenti riviste scientifiche).
3. Costruire reti biologiche per proteine ​​rilasciate dalle cellule stellate epatiche (HSC) che indicano l'attivazione/reversione del fenotipo miofibroblastico (le HSC sono le principali cellule coinvolte nella fibrosi epatica). Vedere la tabella 1.
4. Includere nei nostri studi il noto marcatore dell'attivazione delle HSC (α-actina del muscolo liscio, α-SMA) e un componente essenziale della matrice extracellulare (ECM): il collagene alfa-III tipo I (Col3A1).
5. Scegliere le proteine ​​di interesse, cioè quelle che vengono rilasciate nel siero e che collegano il maggior numero di reti biologiche.

Tabella 1 – Candidati biomarcatori descritti in letteratura Proteina Informazioni rilevanti Localizzazione Citocheratina-18 (CK-18) Indicatore di apoptosi epatocellulare. Proposto come biomarker nella NAFLD Citoplasma, nucleo Proteina legante gli acidi grassi degli adipociti (AFABP) Segnalato come biomarker nella NAFLD Fattore di crescita dei fibroblasti 21 nel citoplasma (FGF21) Aumento dell'espressione nel fegato e nel siero, correlato al grado di steatosi Rilasciata crescita insulino-simile proteina legante il fattore 3 (IGFBP-3) Proposta come biomarcatore per la NAFLD in un recente studio sul proteoma sierico Proteina citosolica 1 dei linfociti secreti (LCP1) Proteina legante l'actina, suggerita come biomarcatore nella NAFLD Citoplasma, membrana Galectina-1 (LGALS1) Aumento dell'espressione nelle HSC attivate Fattore di coniugazione dell'ubiquitina secreto E4B (UBE4B) Aumento dell'espressione nelle HSC attivate Citoplasma secreto Vitronectina (VTN) Aumento dell'espressione nelle HSC inattivate Osteopontina secreta (OPN) Componente della subunità beta 1 della laminina secreta (LAMB1) Componente della ECM HSC inattivate Secrete α-SMA Aumento dell'espressione nelle HSC attivate Citoplasma Col3A1 Aumento della produzione nella fibrogenesi (componente della matrice extracellulare) Secrete

Sulla base dei criteri di lavoro descritti e utilizzando Cytoscape, abbiamo ottenuto una rete biologica integrata (Figura 1), in cui ciascuna delle reti PPI create per le proteine ​​nella Tabella 1 (12 reti biologiche) era collegata tramite proteine ​​di interazione comune (partner comuni). Queste proteine ​​comuni, soprattutto quelle rilasciate dalle cellule (fattori solubili), saranno le nostre proteine ​​bersaglio.

Dalla nostra analisi preliminare, abbiamo identificato le seguenti proteine ​​come potenziali biomarcatori: IGF-2 (fattore di crescita insulino-simile 2), SPARC (proteina secreta acida e ricca di cisteina), EPICAN ed EGFR (recettore del fattore di crescita epidermico) (evidenziato in rosso nella Figura 1).

Piano sperimentale

Le attività di ricerca saranno condotte presso la Fondazione Italiana Fegato. Il prelievo dei campioni avverrà presso il Dipartimento di Chirurgia Generale dell'Ospedale di Cattinara.

Per raggiungere gli obiettivi descritti verranno coinvolti gruppi di pazienti candidati alla chirurgia bariatrica presso l'Unità di Chirurgia Generale. È prevista una visita medica durante la quale verranno raccolte informazioni cliniche generali e verranno rilevate le misurazioni del peso, dell'altezza, della circonferenza vita e della pressione arteriosa. Nell'ambito della preparazione preoperatoria di routine e del follow-up ambulatoriale, i parametri ematologici e biochimici generali (emocromo completo, glucosio, insulina, trigliceridi, colesterolo totale, HDL, transferrina, ferritina, sideremia, proteina C reattiva), fegato la funzionalità (transaminasi, albumina, proteine ​​totali) e la funzionalità renale (creatinina, creatinina urinaria, microalbuminuria) saranno valutate attraverso comuni test di laboratorio su campioni di plasma/siero. Un'ulteriore aliquota dei campioni raccolti verrà utilizzata per l'estrazione di RNA e proteine ​​e la successiva valutazione della qualità del campione. Sottoporsi al prelievo di sangue, che viene eseguito di routine per indagini diagnostiche e valutazione preoperatoria, può comportare un dolore momentaneo nella sede della puntura e la comparsa di un livido (ematoma), complicazioni che possono verificarsi con qualsiasi prelievo di sangue.

Inoltre, prima dell'intervento verrà effettuata un'elastometria epatica che ci permetterà di confrontare i risultati radiologici con quelli di laboratorio. Si tratta di un esame non invasivo simile ad un’ecografia. Tali indagini verranno ripetute dopo un anno dall'intervento per quantificare i miglioramenti attesi, mentre a distanza di sei mesi verrà ripetuto solo il prelievo di sangue. Entrambe le procedure saranno coperte dal Dipartimento di Chirurgia Generale.

Durante l'intervento bariatrico, programmato per l'obesità secondo le linee guida nazionali della SICOB, verranno eseguite biopsie sottocutanee, epatiche e del grasso viscerale. Queste biopsie non prolungano significativamente i tempi chirurgici. In questi tre campioni verrà verificata la presenza e la quantità dei marcatori studiati. Inoltre, una parte della biopsia epatica verrà inviata al reparto di patologia per l'esame istologico definitivo per studiare il grado di fibrosi e steatosi. I campioni raccolti e conservati per questa ricerca verranno utilizzati per monitorare lo stato di salute del paziente. Inoltre, i risultati di questo studio potrebbero essere utili ad altri pazienti contribuendo al miglioramento del trattamento e alla prevenzione della steatosi epatica non alcolica.

Al paziente programmato per l'intervento verrà fornito e spiegato un modulo di consenso informato prima della procedura, in cui vengono descritte le procedure, i rischi e i benefici sopra menzionati.

Il piano sperimentale può essere suddiviso in tre fasi:

Fase 1: studi approfonditi in silico. Tempo stimato: 1 mese.

Fase 2: Studi in vivo, raccolta dei campioni (sangue e fegato), banca dei campioni. Raccolta dei dati clinici e di laboratorio per ciascun paziente.

Estrazione di RNA e proteine, seguita dalla valutazione della qualità del campione. Quantificazione dell'espressione dell'mRNA per il pannello di biomarcatori (Tabella 1 + potenziali biomarcatori).

Quantificazione del siero e dei tessuti (fegato) dei biomarcatori candidati mediante ELISA/Western blot.

Tempo stimato: 9 mesi.

Fase 3: Validazione dei risultati:

I risultati ottenuti verranno correlati con i dati clinico-analitici (valori ematici), con i dati della biopsia epatica (dati istopatologici) e con le tecniche di imaging disponibili (ecografia, elastografia) presso l'Ospedale di Cattinara. Verranno eseguite analisi statistiche per correlare i nuovi biomarcatori con lo stadio della malattia.

Tempo stimato: 2 mesi.

Figura 1: studi in silico.

Dimensione del campione e analisi statistica:

Per lo studio è previsto l'arruolamento di un totale di 62 pazienti, sia ricoverati che ambulatoriali. L’equazione fondamentale per il calcolo della dimensione del campione è la seguente:

N = (2 x (Zα + Zβ)2 x S2) / d2

N = soggetti richiesti in ciascun gruppo campione. Abbiamo stabilito due gruppi: Gruppo A (senza o con fibrosi lieve, Brunt: 0-1) e Gruppo B (fibrosi da moderata a grave, Brunt: 2-3).

Zα = valore Z per il rischio desiderato (per noi è 1,96 per un test bilaterale). Zβ = valore Z per il rischio desiderato (per noi è 1.282 per un test bilaterale). S2 = Varianza o dispersione del parametro quantitativo per il gruppo di controllo o di riferimento (per noi gruppo di riferimento: Gruppo A, valore di dispersione = 150 U/L).

d = Valore minimo della differenza rilevabile (per noi 200 U/L).

La dimensione del campione calcolata per ciascun gruppo utilizzando questa procedura è 29,3. Aggiungendo una correzione per la possibilità di perdita del campione al 5% si ottiene un totale di 30,87. Il numero totale di campioni è 62. Abbiamo applicato questa analisi ad uno dei marcatori dello studio (CK-18) perché è il più riportato in letteratura. Poiché il nostro studio prevede lo studio di 4 biomarcatori, è possibile che lavorare con un pannello di marcatori aumenti la probabilità dei risultati dello studio (riducendo potenzialmente il numero di campioni richiesto).

Utilità dello studio:

Nel campo delle malattie epatiche croniche come la NAFLD, esiste un urgente bisogno di identificare e sviluppare tecniche non invasive per la diagnosi e la prognosi clinica. Questi metodi porteranno a un processo decisionale clinico più rapido, a vantaggio sia dei pazienti che del personale medico. Pertanto, i risultati ottenuti da questo studio mirano a contribuire all’identificazione e alla validazione di nuovi biomarcatori sierici per migliorare la diagnosi, lo screening e il trattamento della NAFLD. Inoltre, si spera che i biomarcatori validati possano essere utilizzati anche come marcatori prognostici in altre malattie epatiche che progrediscono con infiammazione e fibrosi. La disponibilità di biomarcatori non invasivi avrebbe un impatto immediato nella pratica clinica, distinguendo tra individui con un alto tasso di progressione della fibrosi e coloro che potrebbero rimanere in una fase non proliferativa o addirittura ottenere la remissione. Queste informazioni contribuirebbero a una selezione e a un’efficacia più accurate della terapia, migliorando così l’esito complessivo del paziente. Inoltre, l’identificazione di biomarcatori specifici, insieme alla presenza di una banca di campioni biologici nella nostra istituzione, offre la possibilità di studiare approfonditamente i processi molecolari coinvolti non solo in questa condizione ma anche in altri processi fibrogenici nel fegato, con la possibilità di identificazione di nuovi bersagli farmacologici.

Considerata la natura osservazionale dello studio proposto, non sono necessarie polizze assicurative aggiuntive oltre a quelle già previste per la normale pratica clinica.