Biomarkører i diagnose og prognose af NAFLD

Projekt Beskrivelse:

I det moderne samfund, med fremkomsten af ​​industriel udvikling, er livsstilen blevet meget ændret, hvilket har ført til usunde vaner såsom overspisning og fastfood-forbrug (efter en ubalanceret kost rig på sukker og fedt) og nedsat fysisk aktivitet. I EU er over halvdelen af ​​voksne overvægtige eller fede. Denne gruppe af individer anses for at have en høj risiko for udvikling af kroniske leversygdomme såsom ikke-alkoholisk fedtleversygdom (NAFLD). Mange epidemiologiske rapporter har forbundet begyndelsen af ​​NAFLD til dårlige kostvalg og stillesiddende vaner. I øjeblikket er der ingen effektive farmakologiske terapier, og den eneste måde at forebygge eller forbedre tilstanden på er ved at føre en sundere livsstil (personlig tilpasset diæt, fysisk aktivitet og kognitiv adfærdspsykologiske terapier). Hovedbegrænsningen for denne løsning er manglen på patientens tilpasningsevne til terapien.

NAFLD omfatter et bredt histologisk spektrum lige fra simpel steatose til ikke-alkoholisk steatohepatitis (NASH). NASH er karakteriseret ved steatose med betændelse og kan præsentere forskellige stadier af fibrose, fra fraværende til cirrhose. Guldstandarden for diagnose og evaluering af fibrosestadiet forbliver leverbiopsi. Det er imidlertid umuligt at udføre en leverbiopsi for hver mistænkt NAFLD-patient, både af etiske årsager og fordi det ikke er en gyldig screeningsmetode. Derfor er det nødvendigt at udvikle ikke-invasive metoder til screening og diagnosticering. Desuden kan tidlig diagnose øge patienternes bevidsthed om deres kroniske sygdom og motivere dem til at ændre deres livsstil.

I betragtning af dette er det derfor nødvendigt at udvikle ikke-invasive metoder til screening og diagnosticering. Desuden kan tidlig diagnose øge patientens bevidsthed om deres kroniske tilstand og overbevise dem om at ændre deres livsstil.

Det bør overvejes, at det kan være en meget udfordrende opgave at identificere nye markører på grund af:

Fysiopatologiens kompleksitet. Flere faktorer involveret i sygdomsprogression. Tilstedeværelse af almindelige mediatorer i mange andre fibrotiske lidelser. Derfor er en original strategi rettet mod at opdage nye biomarkører af fundamental betydning. Takket være udviklingen af ​​high-throughput teknologier er en enorm mængde genomiske og proteomiske data i dag let tilgængelige i online databaser. Det er således muligt at studere interaktomet (protein-protein-interaktioner -PPI- i en celle) ved hjælp af open source-software såsom Cytoscape. På denne måde giver brugen af ​​bioinformatik os mulighed for at analysere i silico biologiske netværksdata, som repræsenterer en måde at identificere biomarkører af klinisk interesse uden behov for dyrt udstyr.

Objektiv:

Målet med dette projekt er at identificere (gennem i silico-analyse) og validere nye biomarkører, der er nyttige til diagnosticering og prognose af NAFLD, som kan bruges i ikke-invasive kliniske tests.

Vores første tilgang til at identificere kandidatbiomarkører var at bruge følgende arbejdskriterier i silico-studier:

1. Få PPI-data fra databaser, der overholder retningslinjerne fra International Molecular Exchange (IMEx) konsortiet.
2. Konstruer biologiske netværk for proteinerne anført i tabel 1 (som er blevet foreslået som kandidater til diagnosticering af NAFLD i nyere videnskabelige tidsskrifter).
3. Konstruer biologiske netværk for proteiner frigivet af hepatiske stellatceller (HSC'er), der indikerer aktivering/reversion af den myofibroblastiske fænotype (HSC'er er de vigtigste celler involveret i leverfibrose). Se tabel 1.
4. Inkluder i vores undersøgelser den kendte markør for HSC-aktivering (α-glatmuskelaktin, α-SMA) og en væsentlig komponent i den ekstracellulære matrix (ECM): kollagen alpha-III type I (Col3A1).
5. Vælg proteiner af interesse, dvs. dem, der frigives i serumet, og som forbinder det største antal biologiske netværk.

Tabel 1 - Kandidatbiomarkører beskrevet i litteraturen Protein Relevant information Lokalisering Cytokeratin-18 (CK-18) Indikator for hepatocellulær apoptose. Foreslået som en biomarkør i NAFLD Cytoplasma, nucleus Adipocyte fatty acid binding protein (AFABP) Rapporteret som en biomarkør i NAFLD Cytoplasma Fibroblast vækstfaktor 21 (FGF21) Øget ekspression i lever og serum, korreleret med graden af ​​steatose Frigivet insulin-lignende vækst faktorbindende protein 3 (IGFBP-3) Foreslået som en biomarkør for NAFLD i et nyligt serumproteomstudie Sekreteret lymfocyt cytosolisk protein 1 (LCP1) Aktinbindende protein, foreslået som en biomarkør i NAFLD Cytoplasma, membran Galectin-1 (LGALS1) Øget ekspression i aktiverede HSC'er Udskilte Ubiquitin-konjugationsfaktor E4B (UBE4B) Øget ekspression i aktiverede HSC'er Cytoplasma, secerneret Vitronectin (VTN) Øget ekspression i inaktiverede HSC'er Udskilt Osteopontin (OPN) Komponent af den ECM-udskilte Laminin-underenhed beta-ekspression (in1 ) inaktiverede HSC'er Secerneret α-SMA Øget ekspression i aktiverede HSC'er Cytoplasma Col3A1 Øget produktion i fibrogenese (komponent af den ekstracellulære matrix) Secerneret

Baseret på de beskrevne arbejdskriterier og ved hjælp af Cytoscape opnåede vi et integreret biologisk netværk (figur 1), hvor hvert af de PPI-netværk, der blev skabt til proteinerne i tabel 1 (12 biologiske netværk) blev forbundet gennem fælles interaktionsproteiner (fælles partnere). Disse almindelige proteiner, især dem, der frigives af celler (opløselige faktorer), vil være vores målproteiner.

Fra vores foreløbige analyse har vi identificeret følgende proteiner som potentielle biomarkører: IGF-2 (insulinlignende vækstfaktor 2), SPARC (udskilt protein surt og rigt på cystein), EPICAN og EGFR (epidermal vækstfaktor receptor) (fremhævet) i rødt i figur 1).

Eksperimentel plan

Forskningsaktiviteterne vil blive udført ved den italienske leverfond. Prøveindsamlingen vil finde sted på den generelle kirurgiske afdeling på Cattinara Hospital.

For at nå de beskrevne mål vil grupper af patientkandidater til fedmekirurgi på Almindelig Kirurgisk Afdeling blive inddraget. Der er planlagt et lægebesøg, hvor generel klinisk information vil blive indsamlet, og målinger af vægt, højde, taljeomkreds og blodtryk vil blive taget. Som en del af de rutineprægede præoperationspræparater og ambulant opfølgning, generelle hæmatologiske og biokemiske parametre (komplet blodtal, glucose, insulin, triglycerider, total kolesterol, HDL, transferrin, ferritin, serumjern, C-reaktivt protein), lever funktion (transaminaser, albumin, totalt protein) og nyrefunktion (kreatinin, urinkreatinin, mikroalbuminuri) vil blive evalueret gennem almindelige laboratorietests på plasma-/serumprøver. En yderligere alikvot af de indsamlede prøver vil blive brugt til RNA- og proteinekstraktion og efterfølgende vurdering af prøvekvaliteten. At gennemgå en blodprøve, som rutinemæssigt udføres til diagnostiske undersøgelser og præoperativ vurdering, kan involvere øjeblikkelige smerter ved stikningsstedet og forekomsten af ​​et blåt mærke (hæmatom), komplikationer, der kan opstå ved enhver blodopsamling.

Desuden vil der inden operationen blive udført leverelastometri, som vil give os mulighed for at sammenligne de radiologiske resultater med laboratorieresultaterne. Dette er en ikke-invasiv undersøgelse, der ligner en ultralyd. Disse undersøgelser vil blive gentaget efter et år efter operationen for at kvantificere de forventede forbedringer, mens kun blodprøvetagningen vil blive gentaget efter seks måneder. Begge procedurer vil blive dækket af den almindelige kirurgiske afdeling.

Under den fedmekirurgi, som er planlagt for fedme i henhold til SICOB's nationale retningslinjer, vil der blive udført subkutane, lever- og viscerale fedtbiopsier. Disse biopsier forlænger ikke de kirurgiske tider væsentligt. I disse tre prøver vil tilstedeværelsen og mængden af ​​de undersøgte markører blive verificeret. Derudover vil en del af leverbiopsien blive sendt til patologisk afdeling til endelig histologisk undersøgelse for at undersøge graden af ​​fibrose og steatose. De indsamlede og bevarede prøver til denne forskning vil blive brugt til at overvåge patientens helbredstilstand. Desuden kunne resultaterne af denne undersøgelse være nyttige for andre patienter ved at bidrage til forbedring af behandlingen og forebyggelsen af ​​ikke-alkoholisk fedtleversygdom.

Patienten, der er planlagt til operationen, vil få og forklaret en informeret samtykkeformular forud for proceduren, hvor de førnævnte procedurer, risici og fordele er beskrevet.

Forsøgsplanen kan opdeles i tre faser:

Fase 1: Dybdegående i silico studier. Estimeret tid: 1 måned.

Fase 2: In vivo undersøgelser, prøvetagning (blod og lever), prøvebank. Indsamling af kliniske og laboratoriedata for hver patient.

Ekstraktion af RNA og proteiner, efterfulgt af evaluering af prøvekvalitet. Kvantificering af mRNA-ekspression for panelet af biomarkører (tabel 1 + potentielle biomarkører).

Serum og væv (lever) kvantificering af kandidat biomarkører ved hjælp af ELISA/Western blot.

Estimeret tid: 9 måneder.

Fase 3: Validering af resultater:

De opnåede resultater vil blive korreleret med klinisk-analytiske data (blodværdier), leverbiopsidata (histopatologiske data) og tilgængelige billedbehandlingsteknikker (ultralyd, elastografi) på Cattinara Hospital. Statistisk analyse vil blive udført for at korrelere de nye biomarkører med sygdomsstadiet.

Estimeret tid: 2 måneder.

Figur 1: I silico undersøgelser.

Prøvestørrelse og statistisk analyse:

Der er planlagt optagelse af i alt 62 patienter, både indlagte og ambulante patienter, til undersøgelsen. Den grundlæggende ligning til beregning af stikprøvestørrelsen er som følger:

N = (2 x (Zα + Zβ)2 x S2)/d2

N = obligatoriske emner i hver prøvegruppe. Vi etablerede to grupper: Gruppe A (uden eller med mild fibrose, Brunt: 0-1) og Gruppe B (moderat til svær fibrose, Brunt: 2-3).

Zα = Z-værdi for den ønskede risiko (for os er den 1,96 for en bilateral test). Zβ = Z-værdi for den ønskede risiko (for os er den 1,282 for en bilateral test). S2 = Varians eller spredning af den kvantitative parameter for kontrol- eller referencegruppen (for os, referencegruppe: Gruppe A, spredningsværdi = 150 U/L).

d = Minimumværdien af ​​den påviselige forskel (for os, 200 U/L).

Den beregnede stikprøvestørrelse for hver gruppe ved hjælp af denne procedure er 29,3. Tilføjelse af en korrektion for muligheden for prøvetab ved 5 % giver i alt 30,87. Det samlede antal prøver er 62. Vi anvendte denne analyse på en af ​​markørerne i undersøgelsen (CK-18), fordi den er den mest rapporterede i litteraturen. Da vores undersøgelse involverer undersøgelsen af ​​4 biomarkører, er det muligt, at arbejde med et panel af markører vil øge sandsynligheden for undersøgelsesresultater (potentielt reducere det nødvendige antal prøver).

Undersøgelsens nytte:

Inden for kroniske leversygdomme som NAFLD er der et presserende behov for identifikation og udvikling af ikke-invasive teknikker til diagnose og klinisk prognose. Disse metoder vil føre til hurtigere klinisk beslutningstagning, til gavn for både patienter og medicinsk personale. Derfor sigter resultaterne opnået fra denne undersøgelse på at bidrage til identifikation og validering af nye serumbiomarkører for at forbedre diagnosticering, screening og behandling af NAFLD. Desuden er det håbet, at de validerede biomarkører også kan bruges som prognostiske markører ved andre leversygdomme, der udvikler sig med inflammation og fibrose. Tilgængeligheden af ​​ikke-invasive biomarkører vil have en øjeblikkelig indvirkning i klinisk praksis, idet der skelnes mellem individer med en høj fibroseprogressionshastighed og dem, der kan forblive i en ikke-proliferativ fase eller endda opnå remission. Denne information ville bidrage til en mere præcis udvælgelse og effektivitet af behandlingen og derved forbedre det samlede patientresultat. Derudover giver identifikation af specifikke biomarkører, sammen med tilstedeværelsen af ​​en biologisk prøvebank i vores institution, potentialet til grundigt at studere de molekylære processer involveret ikke kun i denne tilstand, men også i andre fibrogene processer i leveren, med mulighed for at identifikation af nye farmakologiske mål.

I betragtning af den foreslåede undersøgelses observationelle karakter kræves der ingen yderligere forsikringspolicer ud over dem, der allerede er fastsat for normal klinisk praksis.