Biomarqueurs dans le diagnostic et le pronostic de la NAFLD

Description du projet:

Dans la société moderne, avec l’avènement du développement industriel, le mode de vie a été considérablement modifié, conduisant à des habitudes malsaines telles que la suralimentation et la consommation de restauration rapide (suite à une alimentation déséquilibrée, riche en sucres et en graisses) et à une activité physique réduite. Dans l’Union européenne, plus de la moitié des adultes sont en surpoids ou obèses. Ce groupe d'individus est considéré comme présentant un risque élevé de développer des maladies chroniques du foie telles que la stéatose hépatique non alcoolique (NAFLD). De nombreux rapports épidémiologiques ont lié l’apparition de la NAFLD à de mauvais choix alimentaires et à des habitudes sédentaires. Actuellement, il n’existe pas de thérapies pharmacologiques efficaces, et le seul moyen de prévenir ou d’améliorer la maladie est de mener un mode de vie plus sain (régimes alimentaires personnalisés, activité physique et thérapies psychologiques cognitivo-comportementales). La principale limite de cette solution est le manque d’adaptabilité du patient à la thérapie.

La NAFLD englobe un large spectre histologique allant de la simple stéatose à la stéatohépatite non alcoolique (NASH). La NASH est caractérisée par une stéatose avec inflammation et peut présenter différents stades de fibrose, de l'absence à la cirrhose. La référence en matière de diagnostic et d’évaluation du stade de fibrose reste la biopsie hépatique. Cependant, réaliser une biopsie hépatique pour chaque patient suspecté de NAFLD est impossible, à la fois pour des raisons éthiques et parce qu’il ne s’agit pas d’une méthode de dépistage valide. Il est donc nécessaire de développer des méthodes non invasives de dépistage et de diagnostic. De plus, un diagnostic précoce pourrait sensibiliser les patients à leur maladie chronique et les motiver à modifier leur mode de vie.

Compte tenu de cela, il est donc nécessaire de développer des méthodes non invasives de dépistage et de diagnostic. De plus, un diagnostic précoce pourrait sensibiliser le patient à sa maladie chronique et le convaincre de modifier son mode de vie.

Il convient de considérer que l’identification de nouveaux marqueurs peut être une tâche très difficile en raison de :

Complexité de la physiopathologie. Plusieurs facteurs impliqués dans la progression de la maladie. Présence de médiateurs communs dans de nombreux autres troubles fibrotiques. Une stratégie originale visant à découvrir de nouveaux biomarqueurs revêt donc une importance fondamentale. Grâce au développement de technologies à haut débit, une énorme quantité de données génomiques et protéomiques est aujourd’hui facilement accessible dans des bases de données en ligne. Il est ainsi possible d'étudier l'interactome (interactions protéine-protéine -PPI- au sein d'une cellule) à l'aide de logiciels open source tels que Cytoscape. Ainsi, l'utilisation de la bioinformatique permet d'analyser in silico les données des réseaux biologiques, ce qui représente un moyen d'identifier des biomarqueurs d'intérêt clinique sans avoir recours à des équipements coûteux.

Objectif:

L'objectif de ce projet est d'identifier (par analyse in silico) et de valider de nouveaux biomarqueurs utiles pour le diagnostic et le pronostic de la NAFLD, pouvant être utilisés dans des tests cliniques non invasifs.

Notre approche initiale pour identifier les biomarqueurs candidats consistait à utiliser les critères de travail suivants dans les études in silico :

1. Obtenez des données PPI à partir de bases de données conformes aux directives du consortium International Molecular Exchange (IMEx).
2. Construire des réseaux biologiques pour les protéines répertoriées dans le tableau 1 (qui ont été proposées comme candidates pour le diagnostic de la NAFLD dans des revues scientifiques récentes).
3. Construire des réseaux biologiques pour les protéines libérées par les cellules étoilées hépatiques (CSH) qui indiquent l'activation/réversion du phénotype myofibroblastique (les CSH sont les principales cellules impliquées dans la fibrose hépatique). Voir le tableau 1.
4. Inclure dans nos études le marqueur connu de l'activation des CSH (actine α-muscle lisse, α-SMA) et un composant essentiel de la matrice extracellulaire (ECM) : le collagène alpha-III type I (Col3A1).
5. Choisissez les protéines d’intérêt, c’est-à-dire celles qui sont libérées dans le sérum et qui connectent le plus grand nombre de réseaux biologiques.

Tableau 1 - Biomarqueurs candidats décrits dans la littérature Protéine Informations pertinentes Localisation Cytokératine-18 (CK-18) Indicateur de l'apoptose hépatocellulaire. Proposé comme biomarqueur dans le cytoplasme de la NAFLD, noyau Protéine de liaison aux acides gras des adipocytes (AFABP) Signalé comme biomarqueur dans le cytoplasme de la NAFLD Facteur de croissance des fibroblastes 21 (FGF21) Expression accrue dans le foie et le sérum, corrélée au degré de stéatose Libéré Croissance de type insulinique protéine de liaison au facteur 3 (IGFBP-3) Proposée comme biomarqueur de la NAFLD dans une étude récente sur le protéome sérique Protéine cytosolique sécrétée des lymphocytes 1 (LCP1) Protéine de liaison à l'actine, suggérée comme biomarqueur de la NAFLD Cytoplasme, galectine membranaire-1 (LGALS1) Augmentation de l'expression dans les CSH activées Facteur de conjugaison de l'ubiquitine sécrété E4B (UBE4B) Augmentation de l'expression dans les CSH activées Cytoplasme, sécrété Vitronectine (VTN) Expression accrue dans les CSH inactivées Ostéopontine sécrétée (OPN) Composant de la sous-unité bêta 1 de laminine sécrétée (LAMB1) de l'ECM Expression réduite dans CSH inactivées Sécrétées α-SMA Augmentation de l'expression dans les CSH activées Cytoplasme Col3A1 Augmentation de la production dans la fibrogenèse (composant de la matrice extracellulaire) Sécrétée

Sur la base des critères de travail décrits et en utilisant Cytoscape, nous avons obtenu un réseau biologique intégré (Figure 1), où chacun des réseaux PPI créés pour les protéines du tableau 1 (12 réseaux biologiques) était connecté via des protéines d'interaction communes (partenaires communs). Ces protéines communes, notamment celles libérées par les cellules (facteurs solubles), seront nos protéines cibles.

À partir de notre analyse préliminaire, nous avons identifié les protéines suivantes comme biomarqueurs potentiels : IGF-2 (insulin-like Growth Factor 2), SPARC (protéine sécrétée acide et riche en cystéine), EPICAN et EGFR (récepteur du facteur de croissance épidermique) (mis en évidence en rouge sur la figure 1).

Plan expérimental

Les activités de recherche seront menées à la Fondation italienne du foie. Le prélèvement des échantillons aura lieu au service de chirurgie générale de l'hôpital de Cattinara.

Pour atteindre les objectifs décrits, des groupes de patients candidats à la chirurgie bariatrique à l'unité de chirurgie générale seront impliqués. Une visite médicale est programmée, au cours de laquelle des informations cliniques générales seront collectées et des mesures de poids, de taille, de tour de taille et de tension artérielle seront prises. Dans le cadre des préparations préopératoires de routine et du suivi ambulatoire, les paramètres généraux hématologiques et biochimiques (formule sanguine complète, glucose, insuline, triglycérides, cholestérol total, HDL, transferrine, ferritine, fer sérique, protéine C-réactive), foie la fonction (transaminases, albumine, protéines totales) et la fonction rénale (créatinine, créatinine urinaire, microalbuminurie) seront évaluées par des tests de laboratoire communs sur des échantillons de plasma/sérum. Une aliquote supplémentaire des échantillons collectés sera utilisée pour l'extraction de l'ARN et des protéines et l'évaluation ultérieure de la qualité des échantillons. La prise de sang, qui est régulièrement réalisée pour les investigations diagnostiques et l'évaluation préopératoire, peut entraîner une douleur momentanée au niveau du site de ponction et l'apparition d'une ecchymose (hématome), complications pouvant survenir lors de toute prise de sang.

De plus, avant l'intervention chirurgicale, une élastométrie hépatique sera réalisée, ce qui permettra de comparer les résultats radiologiques avec les résultats de laboratoire. Il s’agit d’un examen non invasif semblable à une échographie. Ces investigations seront répétées un an après l'intervention chirurgicale pour quantifier les améliorations attendues, tandis que seule la prise de sang sera répétée après six mois. Les deux procédures seront prises en charge par le service de chirurgie générale.

Au cours de la chirurgie bariatrique, prévue pour l'obésité selon les directives nationales du SICOB, des biopsies de graisse sous-cutanée, hépatique et viscérale seront réalisées. Ces biopsies ne prolongent pas significativement les délais opératoires. Dans ces trois échantillons, la présence et la quantité des marqueurs étudiés seront vérifiées. De plus, une partie de la biopsie hépatique sera envoyée au service de pathologie pour un examen histologique définitif afin d'étudier le degré de fibrose et de stéatose. Les échantillons collectés et conservés pour cette recherche seront utilisés pour surveiller l'état de santé du patient. De plus, les résultats de cette étude pourraient être utiles à d’autres patients en contribuant à l’amélioration du traitement et de la prévention de la stéatose hépatique non alcoolique.

Le patient prévu pour l'intervention chirurgicale recevra et expliquera un formulaire de consentement éclairé avant la procédure, où les procédures, les risques et les avantages susmentionnés sont décrits.

Le plan expérimental peut être divisé en trois phases :

Phase 1 : Études approfondies in silico. Durée estimée : 1 mois.

Phase 2 : Etudes in vivo, prélèvement d'échantillons (sang et foie), banque d'échantillons. Collecte de données cliniques et de laboratoire pour chaque patient.

Extraction d'ARN et de protéines, suivie de l'évaluation de la qualité des échantillons. Quantification de l’expression de l’ARNm pour le panel de biomarqueurs (Tableau 1 + biomarqueurs potentiels).

Quantification sérique et tissulaire (foie) de biomarqueurs candidats par ELISA/Western blot.

Durée estimée : 9 mois.

Phase 3 : Validation des résultats :

Les résultats obtenus seront corrélés aux données cliniques-analytiques (valeurs sanguines), aux données de biopsie hépatique (données histopathologiques) et aux techniques d'imagerie disponibles (échographie, élastographie) à l'hôpital de Cattinara. Une analyse statistique sera effectuée pour corréler les nouveaux biomarqueurs avec le stade de la maladie.

Durée estimée : 2 mois.

Figure 1 : Études in silico.

Taille de l’échantillon et analyse statistique :

Le recrutement d'un total de 62 patients, hospitalisés et ambulatoires, est prévu pour l'étude. L’équation fondamentale pour calculer la taille de l’échantillon est la suivante :

N = (2 x (Zα + Zβ)2 x S2) / d2

N = sujets requis dans chaque groupe échantillon. Nous avons constitué deux groupes : Groupe A (sans ou avec fibrose légère, Brunt : 0-1) et Groupe B (fibrose modérée à sévère, Brunt : 2-3).

Zα = valeur Z pour le risque souhaité (pour nous, elle est de 1,96 pour un test bilatéral). Zβ = valeur Z pour le risque souhaité (pour nous, elle est de 1,282 pour un test bilatéral). S2 = Variance ou dispersion du paramètre quantitatif pour le groupe témoin ou de référence (pour nous, groupe de référence : Groupe A, valeur de dispersion = 150 U/L).

d = Valeur minimale de la différence détectable (pour nous, 200 U/L).

La taille de l'échantillon calculée pour chaque groupe utilisant cette procédure est de 29,3. L'ajout d'une correction pour la possibilité de perte d'échantillon à 5 % donne un total de 30,87. Le nombre total d'échantillons est de 62. Nous avons appliqué cette analyse à l'un des marqueurs de l'étude (CK-18) car il est le plus rapporté dans la littérature. Étant donné que notre étude implique l'étude de 4 biomarqueurs, il est possible que travailler avec un panel de marqueurs augmente la probabilité d'obtenir des résultats de l'étude (réduisant potentiellement le nombre d'échantillons requis).

Utilité de l'étude :

Dans le domaine des maladies hépatiques chroniques telles que la NAFLD, il existe un besoin urgent d’identification et de développement de techniques non invasives pour le diagnostic et le pronostic clinique. Ces méthodes permettront d’accélérer la prise de décision clinique, ce qui bénéficiera à la fois aux patients et au personnel médical. Par conséquent, les résultats obtenus de cette étude visent à contribuer à l'identification et à la validation de nouveaux biomarqueurs sériques pour améliorer le diagnostic, le dépistage et le traitement de la NAFLD. En outre, on espère que les biomarqueurs validés pourront également être utilisés comme marqueurs pronostiques dans d’autres maladies du foie évoluant avec une inflammation et une fibrose. La disponibilité de biomarqueurs non invasifs aurait un impact immédiat sur la pratique clinique, en distinguant les individus présentant un taux de progression élevé de la fibrose de ceux qui pourraient rester dans une phase non proliférative ou même atteindre une rémission. Ces informations contribueraient à une sélection et à une efficacité plus précises du traitement, améliorant ainsi les résultats globaux pour le patient. De plus, l'identification de biomarqueurs spécifiques, ainsi que la présence d'une banque d'échantillons biologiques dans notre institution, offrent la possibilité d'étudier en profondeur les processus moléculaires impliqués non seulement dans cette maladie mais également dans d'autres processus fibrogènes du foie, avec la possibilité de identifier de nouvelles cibles pharmacologiques.

Compte tenu de la nature observationnelle de l'étude proposée, aucune police d'assurance supplémentaire n'est requise au-delà de celles déjà prévues pour la pratique clinique normale.