Biomarkers bij de diagnose en prognose van NAFLD

Projectbeschrijving:

In de moderne samenleving is met de komst van de industriële ontwikkeling de levensstijl sterk veranderd, wat heeft geleid tot ongezonde gewoonten zoals overeten en fastfoodconsumptie (na een onevenwichtig dieet dat rijk is aan suikers en vetten) en verminderde fysieke activiteit. In de Europese Unie heeft meer dan de helft van de volwassenen overgewicht of obesitas. Er wordt aangenomen dat deze groep individuen een hoog risico loopt op de ontwikkeling van chronische leverziekten zoals niet-alcoholische leververvetting (NAFLD). Veel epidemiologische rapporten hebben het ontstaan ​​van NAFLD in verband gebracht met slechte voedingskeuzes en sedentaire gewoonten. Momenteel zijn er geen effectieve farmacologische therapieën, en de enige manier om de aandoening te voorkomen of te verbeteren is door een gezondere levensstijl te leiden (gepersonaliseerde diëten, fysieke activiteit en cognitief-gedragsmatige psychologische therapieën). De belangrijkste beperking van deze oplossing is het gebrek aan aanpassingsvermogen van de patiënt aan de therapie.

NAFLD omvat een breed histologisch spectrum, variërend van eenvoudige steatose tot niet-alcoholische steatohepatitis (NASH). NASH wordt gekenmerkt door steatose met ontsteking en kan verschillende stadia van fibrose vertonen, van afwezig tot cirrose. De gouden standaard voor de diagnose en evaluatie van het fibrosestadium blijft leverbiopsie. Het uitvoeren van een leverbiopsie bij elke vermoedelijke NAFLD-patiënt is echter onmogelijk, zowel om ethische redenen als omdat het geen geldige screeningsmethode is. Daarom is het noodzakelijk om niet-invasieve methoden voor screening en diagnose te ontwikkelen. Bovendien kan een vroege diagnose het bewustzijn van patiënten over hun chronische ziekte vergroten en hen motiveren hun levensstijl te veranderen.

Dit in aanmerking genomen is het daarom noodzakelijk om niet-invasieve methoden voor screening en diagnose te ontwikkelen. Bovendien zou een vroege diagnose het bewustzijn van de patiënt over zijn chronische aandoening kunnen vergroten en hem ervan kunnen overtuigen zijn levensstijl te veranderen.

Er moet rekening mee worden gehouden dat het identificeren van nieuwe markers een zeer uitdagende taak kan zijn vanwege:

Complexiteit van fysiopathologie. Meerdere factoren die betrokken zijn bij ziekteprogressie. Aanwezigheid van gemeenschappelijke mediatoren bij veel andere fibrotische aandoeningen. Daarom is een originele strategie gericht op het ontdekken van nieuwe biomarkers van fundamenteel belang. Dankzij de ontwikkeling van high-throughput-technologieën is tegenwoordig een enorme hoeveelheid genomische en proteomische gegevens gemakkelijk toegankelijk in online databases. Het is dus mogelijk om het interactoom (eiwit-eiwitinteracties -PPI- binnen een cel) te bestuderen met behulp van open-sourcesoftware zoals Cytoscape. Op deze manier stelt het gebruik van bio-informatica ons in staat biologische netwerkgegevens in silico te analyseren, wat een manier is om biomarkers van klinisch belang te identificeren zonder de noodzaak van dure apparatuur.

Objectief:

Het doel van dit project is het identificeren (via in silico-analyse) en valideren van nieuwe biomarkers die nuttig zijn voor de diagnose en prognose van NAFLD, die kunnen worden gebruikt in niet-invasieve klinische tests.

Onze aanvankelijke aanpak bij het identificeren van kandidaat-biomarkers was het gebruik van de volgende werkcriteria in in silico-onderzoeken:

1. Verkrijg PPI-gegevens uit databases die voldoen aan de richtlijnen van het International Molecular Exchange (IMEx) consortium.
2. Construeer biologische netwerken voor de eiwitten opgesomd in Tabel 1 (die in recente wetenschappelijke tijdschriften zijn voorgesteld als kandidaten voor de diagnose van NAFLD).
3. Construeer biologische netwerken voor eiwitten die vrijkomen door hepatische stellaatcellen (HSC's) die activatie/omkering van het myofibroblastische fenotype aangeven (HSC's zijn de belangrijkste cellen die betrokken zijn bij leverfibrose). Zie Tabel 1.
4. Neem in onze onderzoeken de bekende marker van HSC-activering (α-gladde spieractine, α-SMA) en een essentieel onderdeel van de extracellulaire matrix (ECM) op: collageen alfa-III type I (Col3A1).
5. Kies de eiwitten die van belang zijn, dat wil zeggen de eiwitten die vrijkomen in het serum en die het grootste aantal biologische netwerken verbinden.

Tabel 1 - Kandidaat-biomarkers beschreven in de literatuur Eiwit Relevante informatie Lokalisatie Cytokeratine-18 (CK-18) Indicator van hepatocellulaire apoptose. Voorgesteld als biomarker in NAFLD Cytoplasma, kern Adipocyt vetzuurbindend eiwit (AFABP) Gerapporteerd als biomarker in NAFLD Cytoplasma Fibroblastgroeifactor 21 (FGF21) Verhoogde expressie in de lever en het serum, gecorreleerd met de mate van steatose Vrijgegeven insuline-achtige groei factor-bindend eiwit 3 (IGFBP-3) Voorgesteld als biomarker voor NAFLD in een recent serumproteoomonderzoek Uitgescheiden lymfocyt cytosolisch eiwit 1 (LCP1) Actine-bindend eiwit, voorgesteld als biomarker bij NAFLD Cytoplasma, membraan Galectine-1 (LGALS1) Verhoogde expressie in geactiveerde HSC's Uitgescheiden ubiquitine-conjugatiefactor E4B (UBE4B) Verhoogde expressie in geactiveerde HSC's Cytoplasma, uitgescheiden vitronectine (VTN) Verhoogde expressie in geïnactiveerde HSC's Uitgescheiden osteopontine (OPN) Component van de ECM Uitgescheiden laminine-subeenheid bèta 1 (LAMB1) Verminderde expressie in geïnactiveerde HSC’s Uitgescheiden α-SMA Verhoogde expressie in geactiveerde HSC’s Cytoplasma Col3A1 Verhoogde productie bij fibrogenese (component van de extracellulaire matrix) Uitgescheiden

Op basis van de beschreven werkcriteria en met behulp van Cytoscape hebben we een geïntegreerd biologisch netwerk verkregen (Figuur 1), waarbij elk van de PPI-netwerken gecreëerd voor de eiwitten in Tabel 1 (12 biologische netwerken) was verbonden via gemeenschappelijke interactie-eiwitten (gemeenschappelijke partners). Deze veel voorkomende eiwitten, vooral die welke door cellen worden vrijgegeven (oplosbare factoren), zullen onze doeleiwitten zijn.

Uit onze voorlopige analyse hebben we de volgende eiwitten geïdentificeerd als potentiële biomarkers: IGF-2 (insulineachtige groeifactor 2), SPARC (uitgescheiden eiwit, zuur en rijk aan cysteïne), EPICAN en EGFR (epidermale groeifactorreceptor) (gemarkeerd in rood in Figuur 1).

Experimenteel plan

De onderzoeksactiviteiten zullen worden uitgevoerd bij de Italiaanse Leverstichting. De monsterafname vindt plaats op de afdeling Algemene Chirurgie van het Cattinara Ziekenhuis.

Om de beschreven doelstellingen te bereiken worden groepen patiënten betrokken die in aanmerking komen voor bariatrische chirurgie op de afdeling Algemene Chirurgie. Er staat een medisch bezoek gepland, waarbij algemene klinische informatie wordt verzameld en metingen van gewicht, lengte, tailleomtrek en bloeddruk worden uitgevoerd. Als onderdeel van de routinematige voorbereidingen vóór de operatie en poliklinische follow-up, worden algemene hematologische en biochemische parameters (volledig bloedbeeld, glucose, insuline, triglyceriden, totaal cholesterol, HDL, transferrine, ferritine, serumijzer, C-reactief proteïne), lever functie (transaminasen, albumine, totaal eiwit) en nierfunctie (creatinine, urinecreatinine, microalbuminurie) zullen worden geëvalueerd door middel van algemene laboratoriumtests op plasma-/serummonsters. Een extra portie van de verzamelde monsters zal worden gebruikt voor RNA- en eiwitextractie en daaropvolgende beoordeling van de monsterkwaliteit. Het ondergaan van een bloedafname, die routinematig wordt uitgevoerd voor diagnostisch onderzoek en preoperatieve beoordeling, kan gepaard gaan met kortstondige pijn op de prikplaats en het optreden van een blauwe plek (hematoom), complicaties die kunnen optreden bij elke bloedafname.

Bovendien zal vóór de operatie leverelastometrie worden uitgevoerd, waardoor we de radiologische resultaten kunnen vergelijken met de laboratoriumresultaten. Dit is een niet-invasief onderzoek, vergelijkbaar met een echografie. Deze onderzoeken zullen één jaar na de operatie worden herhaald om de verwachte verbeteringen te kwantificeren, terwijl alleen de bloedafname na zes maanden zal worden herhaald. Beide ingrepen vallen onder de afdeling Algemene Chirurgie.

Tijdens de bariatrische operatie, die gepland is voor obesitas volgens de nationale richtlijnen van SICOB, zullen subcutane, lever- en viscerale vetbiopten worden uitgevoerd. Deze biopsieën verlengen de operatieduur niet significant. In deze drie monsters zal de aanwezigheid en hoeveelheid van de onderzochte markers worden geverifieerd. Daarnaast wordt een deel van de leverbiopsie naar de afdeling pathologie gestuurd voor definitief histologisch onderzoek om de mate van fibrose en steatose te onderzoeken. De voor dit onderzoek verzamelde en bewaarde monsters zullen worden gebruikt om de gezondheidstoestand van de patiënt te monitoren. Bovendien kunnen de resultaten van dit onderzoek nuttig zijn voor andere patiënten door bij te dragen aan de verbetering van de behandeling en preventie van niet-alcoholische leververvetting.

De patiënt die voor de operatie is gepland, krijgt voorafgaand aan de procedure een formulier voor geïnformeerde toestemming, waarin de bovengenoemde procedures, risico's en voordelen worden beschreven.

Het proefplan kan in drie fasen worden verdeeld:

Fase 1: Verdieping in silicostudies. Geschatte tijd: 1 maand.

Fase 2: In vivo onderzoeken, monsterafname (bloed en lever), monsterbank. Verzameling van klinische en laboratoriumgegevens voor elke patiënt.

Extractie van RNA en eiwitten, gevolgd door de evaluatie van de monsterkwaliteit. Kwantificering van mRNA-expressie voor het panel van biomarkers (Tabel 1 + potentiële biomarkers).

Kwantificering van serum en weefsel (lever) van kandidaat-biomarkers met behulp van ELISA/Western blot.

Geschatte tijd: 9 maanden.

Fase 3: Validatie van resultaten:

De verkregen resultaten zullen worden gecorreleerd met klinisch-analytische gegevens (bloedwaarden), leverbiopsiegegevens (histopathologische gegevens) en beschikbare beeldvormingstechnieken (echografie, elastografie) in het Cattinara Ziekenhuis. Er zal statistische analyse worden uitgevoerd om de nieuwe biomarkers te correleren met het stadium van de ziekte.

Geschatte tijd: 2 maanden.

Figuur 1: In silico-onderzoeken.

Steekproefomvang en statistische analyse:

De inschrijving van in totaal 62 patiënten, zowel intramuraal als poliklinisch, is gepland voor het onderzoek. De fundamentele vergelijking voor het berekenen van de steekproefomvang is als volgt:

N = (2 x (Zα + Zβ)2 x S2) / d2

N = verplichte onderwerpen in elke steekproefgroep. We hebben twee groepen samengesteld: Groep A (zonder of met milde fibrose, Brunt: 0-1) en Groep B (matige tot ernstige fibrose, Brunt: 2-3).

Zα = Z-waarde voor het gewenste risico (bij ons is dit 1,96 voor een bilaterale test). Zβ = Z-waarde voor het gewenste risico (bij ons is dit 1,282 voor een bilaterale test). S2 = Variantie of spreiding van de kwantitatieve parameter voor de controle- of referentiegroep (voor ons referentiegroep: Groep A, spreidingswaarde = 150 U/L).

d = Minimumwaarde van het detecteerbare verschil (voor ons 200 U/L).

De berekende steekproefomvang voor elke groep die deze procedure gebruikt, is 29,3. Het toevoegen van een correctie voor de mogelijkheid van monsterverlies bij 5% levert een totaal op van 30,87. Het totale aantal monsters bedraagt ​​62. We hebben deze analyse toegepast op een van de markers in het onderzoek (CK-18), omdat deze in de literatuur het meest wordt gerapporteerd. Omdat ons onderzoek de studie van 4 biomarkers omvat, is het mogelijk dat het werken met een panel van markers de kans op onderzoeksresultaten vergroot (waardoor mogelijk het vereiste aantal monsters wordt verminderd).

Nut van de studie:

Op het gebied van chronische leverziekten zoals NAFLD is er een dringende behoefte aan de identificatie en ontwikkeling van niet-invasieve technieken voor diagnose en klinische prognose. Deze methoden zullen leiden tot snellere klinische besluitvorming, wat zowel patiënten als medisch personeel ten goede zal komen. Daarom zijn de resultaten van deze studie bedoeld om bij te dragen aan de identificatie en validatie van nieuwe serumbiomarkers om de diagnose, screening en behandeling van NAFLD te verbeteren. Bovendien wordt gehoopt dat de gevalideerde biomarkers ook kunnen worden gebruikt als prognostische markers bij andere leverziekten die verergeren met ontstekingen en fibrose. De beschikbaarheid van niet-invasieve biomarkers zou een onmiddellijke impact hebben in de klinische praktijk, waarbij onderscheid zou worden gemaakt tussen individuen met een hoge mate van fibroseprogressie en degenen die mogelijk in een niet-proliferatieve fase blijven of zelfs remissie bereiken. Deze informatie zou bijdragen aan een nauwkeurigere selectie en effectiviteit van de therapie, waardoor de algehele uitkomst voor de patiënt zou verbeteren. Bovendien biedt de identificatie van specifieke biomarkers, samen met de aanwezigheid van een biologische monsterbank in onze instelling, het potentieel om de moleculaire processen die niet alleen bij deze aandoening betrokken zijn, maar ook bij andere fibrogene processen in de lever grondig te bestuderen, met de mogelijkheid om het identificeren van nieuwe farmacologische doelwitten.

Gezien het observationele karakter van het voorgestelde onderzoek zijn er geen aanvullende verzekeringen nodig naast de verzekeringen die al zijn voorzien voor de normale klinische praktijk.