Biomarcadores no diagnóstico e prognóstico da DHGNA

Descrição do Projeto:

Na sociedade moderna, com o advento do desenvolvimento industrial, o estilo de vida foi bastante modificado, levando a hábitos pouco saudáveis, como a alimentação excessiva e o consumo de fast food (seguindo uma dieta desequilibrada, rica em açúcares e gorduras) e à redução da atividade física. Na União Europeia, mais de metade dos adultos têm excesso de peso ou são obesos. Este grupo de indivíduos é considerado de alto risco para o desenvolvimento de doenças hepáticas crônicas, como a doença hepática gordurosa não alcoólica (DHGNA). Muitos relatórios epidemiológicos associaram o início da DHGNA a más escolhas alimentares e hábitos sedentários. Atualmente, não existem terapias farmacológicas eficazes e a única forma de prevenir ou melhorar o quadro é levando um estilo de vida mais saudável (dietas personalizadas, atividade física e terapias psicológicas cognitivo-comportamentais). A principal limitação desta solução é a falta de adaptabilidade do paciente à terapia.

A DHGNA abrange um amplo espectro histológico que vai desde a esteatose simples até a esteatohepatite não alcoólica (EHNA). A EHNA é caracterizada por esteatose com inflamação e pode apresentar diferentes estágios de fibrose, desde ausente até cirrose. O padrão ouro para diagnóstico e avaliação do estágio de fibrose continua sendo a biópsia hepática. No entanto, a realização de uma biópsia hepática para todos os pacientes com suspeita de DHGNA é impossível, tanto por razões éticas como porque não é um método de rastreio válido. Portanto, é necessário desenvolver métodos não invasivos para triagem e diagnóstico. Além disso, o diagnóstico precoce poderia aumentar a consciência dos pacientes sobre a sua doença crónica e motivá-los a mudar o seu estilo de vida.

Considerando isto, é necessário desenvolver métodos não invasivos de rastreio e diagnóstico. Além disso, o diagnóstico precoce poderia aumentar a consciência do paciente sobre sua condição crônica e convencê-lo a mudar seu estilo de vida.

Deve-se considerar que identificar novos marcadores pode ser uma tarefa bastante desafiadora devido a:

Complexidade da fisiopatologia. Múltiplos fatores envolvidos na progressão da doença. Presença de mediadores comuns em muitos outros distúrbios fibróticos. Portanto, uma estratégia original que vise a descoberta de novos biomarcadores é de fundamental importância. Graças ao desenvolvimento de tecnologias de alto rendimento, hoje em dia uma enorme quantidade de dados genómicos e proteómicos é facilmente acessível em bases de dados online. Assim, é possível estudar o interactoma (interações proteína-proteína -PPI- dentro de uma célula) usando software de código aberto como o Cytoscape. Dessa forma, o uso da bioinformática permite analisar dados de redes biológicas in silico, o que representa uma forma de identificar biomarcadores de interesse clínico sem a necessidade de equipamentos caros.

Objetivo:

O objetivo deste projeto é identificar (através de análise in silico) e validar novos biomarcadores úteis para o diagnóstico e prognóstico da DHGNA, que possam ser utilizados em testes clínicos não invasivos.

Nossa abordagem inicial na identificação de biomarcadores candidatos foi usar os seguintes critérios de trabalho em estudos in silico:

1. Obtenha dados PPI de bancos de dados que aderem às diretrizes do consórcio International Molecular Exchange (IMEx).
2. Construir redes biológicas para as proteínas listadas na Tabela 1 (que foram propostas como candidatas para o diagnóstico de DHGNA em revistas científicas recentes).
3. Construir redes biológicas para proteínas liberadas por células estreladas hepáticas (HSCs) que indicam ativação/reversão do fenótipo miofibroblástico (HSCs são as principais células envolvidas na fibrose hepática). Consulte a Tabela 1.
4. Incluir em nossos estudos o conhecido marcador de ativação de HSC (α-actina de músculo liso, α-SMA) e um componente essencial da matriz extracelular (MEC): colágeno alfa-III tipo I (Col3A1).
5. Escolha proteínas de interesse, ou seja, aquelas que são liberadas no soro e que conectam o maior número de redes biológicas.

Tabela 1 - Biomarcadores candidatos descritos na literatura Proteína Informação relevante Localização Citoqueratina-18 (CK-18) Indicador de apoptose hepatocelular. Proposto como biomarcador na DHGNA Citoplasma, núcleo Proteína de ligação a ácidos graxos de adipócitos (AFABP) Relatado como biomarcador na DHGNA Citoplasma Fator de crescimento de fibroblastos 21 (FGF21) Aumento da expressão no fígado e soro, correlacionado com o grau de esteatose Liberação de crescimento semelhante à insulina proteína de ligação ao fator 3 (IGFBP-3) Proposta como biomarcador para DHGNA em um estudo recente de proteoma sérico Proteína 1 citosólica de linfócitos secretados (LCP1) Proteína de ligação à actina, sugerida como biomarcador em DHGNA Citoplasma, membrana Galectina-1 (LGALS1) Expressão aumentada em HSCs ativadas Fator de conjugação de ubiquitina secretada E4B (UBE4B) Expressão aumentada em HSCs ativadas Citoplasma, Vitronectina secretada (VTN) Expressão aumentada em HSCs inativadas Osteopontina secretada (OPN) Componente da subunidade beta 1 da laminina secretada da MEC (LAMB1) Expressão reduzida em HSCs inativadas α-SMA secretada Aumento da expressão em HSCs ativadas Citoplasma Col3A1 Aumento da produção na fibrogênese (componente da matriz extracelular) Secretado

Com base nos critérios de trabalho descritos e utilizando Cytoscape, obtivemos uma rede biológica integrada (Figura 1), onde cada uma das redes PPI criadas para as proteínas da Tabela 1 (12 redes biológicas) foi conectada através de proteínas de interação comuns (parceiros comuns). Estas proteínas comuns, especialmente aquelas liberadas pelas células (fatores solúveis), serão nossas proteínas alvo.

A partir de nossa análise preliminar, identificamos as seguintes proteínas como potenciais biomarcadores: IGF-2 (fator de crescimento semelhante à insulina 2), SPARC (proteína secretada ácida e rica em cisteína), EPICAN e EGFR (receptor do fator de crescimento epidérmico) (destacado em vermelho na Figura 1).

Plano Experimental

As atividades de pesquisa serão realizadas na Fundação Italiana do Fígado. A coleta da amostra ocorrerá no Serviço de Cirurgia Geral do Hospital Cattinara.

Para atingir os objetivos descritos serão envolvidos grupos de pacientes candidatos à cirurgia bariátrica na Unidade de Cirurgia Geral. É agendada consulta médica, durante a qual serão coletadas informações clínicas gerais e medidas de peso, altura, circunferência da cintura e pressão arterial. Como parte dos preparativos pré-operatórios de rotina e do acompanhamento ambulatorial, foram avaliados parâmetros hematológicos e bioquímicos gerais (hemograma completo, glicemia, insulina, triglicerídeos, colesterol total, HDL, transferrina, ferritina, ferro sérico, proteína C reativa), fígado função (transaminases, albumina, proteína total) e função renal (creatinina, creatinina urinária, microalbuminúria) serão avaliadas através de testes laboratoriais comuns em amostras de plasma/soro. Uma alíquota adicional das amostras coletadas será utilizada para extração de RNA e proteínas e posterior avaliação da qualidade da amostra. A coleta de sangue, realizada rotineiramente para investigação diagnóstica e avaliação pré-operatória, pode envolver dor momentânea no local da punção e aparecimento de hematoma (hematoma), complicações que podem ocorrer com qualquer coleta de sangue.

Além disso, antes da cirurgia será realizada elastometria hepática, o que nos permitirá comparar os resultados radiológicos com os laboratoriais. Este é um exame não invasivo semelhante a um ultrassom. Essas investigações serão repetidas um ano após a cirurgia para quantificar as melhorias esperadas, enquanto apenas a coleta de sangue será repetida após seis meses. Ambos os procedimentos serão cobertos pelo Departamento de Cirurgia Geral.

Durante a cirurgia bariátrica, programada para obesidade de acordo com as diretrizes nacionais do SICOB, serão realizadas biópsias de gordura subcutânea, hepática e visceral. Essas biópsias não prolongam significativamente o tempo cirúrgico. Nestas três amostras será verificada a presença e quantidade dos marcadores estudados. Além disso, uma parte da biópsia hepática será enviada ao departamento de patologia para exame histológico definitivo para estudar o grau de fibrose e esteatose. As amostras coletadas e preservadas para esta pesquisa serão utilizadas para monitorar o estado de saúde do paciente. Além disso, os resultados deste estudo podem ser úteis para outros pacientes, contribuindo para a melhoria do tratamento e prevenção da doença hepática gordurosa não alcoólica.

O paciente agendado para a cirurgia receberá e explicará um termo de consentimento livre e esclarecido antes do procedimento, onde são descritos os procedimentos, riscos e benefícios acima mencionados.

O plano experimental pode ser dividido em três fases:

Fase 1: Estudos aprofundados in silico. Tempo estimado: 1 mês.

Fase 2: Estudos in vivo, coleta de amostras (sangue e fígado), banco de amostras. Coleta de dados clínicos e laboratoriais de cada paciente.

Extração de RNA e proteínas, seguida de avaliação da qualidade da amostra. Quantificação da expressão de mRNA para o painel de biomarcadores (Tabela 1 + potenciais biomarcadores).

Quantificação de soro e tecido (fígado) de biomarcadores candidatos usando ELISA/Western blot.

Tempo estimado: 9 meses.

Fase 3: Validação dos resultados:

Os resultados obtidos serão correlacionados com dados clínico-analíticos (valores sanguíneos), dados de biópsia hepática (dados histopatológicos) e técnicas de imagem disponíveis (ultrassonografia, elastografia) no Hospital Cattinara. Será realizada análise estatística para correlacionar os novos biomarcadores com o estágio da doença.

Tempo estimado: 2 meses.

Figura 1: Estudos in silico.

Tamanho da amostra e análise estatística:

A inscrição de um total de 62 pacientes, tanto internados quanto ambulatoriais, está prevista para o estudo. A equação fundamental para calcular o tamanho da amostra é a seguinte:

N = (2 x (Zα + Zβ)2 x S2) / d2

N = sujeitos obrigatórios em cada grupo amostral. Estabelecemos dois grupos: Grupo A (sem ou com fibrose leve, Brunt: 0-1) e Grupo B (fibrose moderada a grave, Brunt: 2-3).

Zα = valor Z do risco desejado (para nós é 1,96 para um teste bilateral). Zβ = valor Z para o risco desejado (para nós é 1,282 para um teste bilateral). S2 = Variância ou dispersão do parâmetro quantitativo para o grupo controle ou referência (para nós, grupo de referência: Grupo A, valor de dispersão = 150 U/L).

d = Valor mínimo da diferença detectável (para nós, 200 U/L).

O tamanho da amostra calculado para cada grupo usando este procedimento é 29,3. Adicionando uma correção para a possibilidade de perda amostral em 5% resulta em um total de 30,87. O número total de amostras é 62. Aplicamos essa análise a um dos marcadores do estudo (CK-18) por ser o mais relatado na literatura. Como nosso estudo envolve o estudo de 4 biomarcadores, é possível que trabalhar com um painel de marcadores aumente a probabilidade de resultados do estudo (reduzindo potencialmente o número necessário de amostras).

Utilidade do estudo:

No campo das doenças hepáticas crónicas, como a NAFLD, existe uma necessidade urgente de identificação e desenvolvimento de técnicas não invasivas para diagnóstico e prognóstico clínico. Esses métodos levarão a uma tomada de decisão clínica mais rápida, beneficiando tanto os pacientes quanto a equipe médica. Portanto, os resultados obtidos neste estudo visam contribuir para a identificação e validação de novos biomarcadores séricos para melhorar o diagnóstico, rastreamento e tratamento da DHGNA. Além disso, espera-se que os biomarcadores validados também possam ser utilizados como marcadores prognósticos em outras doenças hepáticas que progridem com inflamação e fibrose. A disponibilidade de biomarcadores não invasivos teria um impacto imediato na prática clínica, distinguindo entre indivíduos com elevada taxa de progressão da fibrose e aqueles que podem permanecer numa fase não proliferativa ou mesmo alcançar a remissão. Esta informação contribuiria para uma seleção e eficácia mais precisas da terapia, melhorando assim o resultado geral do paciente. Adicionalmente, a identificação de biomarcadores específicos, juntamente com a presença de um banco de amostras biológicas na nossa instituição, proporciona o potencial para estudar exaustivamente os processos moleculares envolvidos não só nesta condição, mas também em outros processos fibrogénicos no fígado, com a possibilidade de identificação de novos alvos farmacológicos.

Dada a natureza observacional do estudo proposto, não são necessárias apólices de seguro adicionais além daquelas já fornecidas para a prática clínica normal.