NAFLD の診断と予後におけるバイオマーカー

プロジェクトの説明：

現代社会では、産業の発展に伴いライフスタイルが大きく変化し、過食やファストフードの摂取（糖分や脂肪分の偏った食事）、身体活動の低下などの不健康な習慣が蔓延しています。 欧州連合では、成人の半数以上が過体重または肥満です。 このグループの人々は、非アルコール性脂肪肝疾患（NAFLD）などの慢性肝疾患を発症するリスクが高いと考えられています。 多くの疫学報告では、NAFLD の発症は不適切な食事の選択と座りっぱなしの習慣に関連付けられています。 現在、効果的な薬物療法はなく、この状態を予防または改善する唯一の方法は、より健康的なライフスタイル（個人に合わせた食事、身体活動、認知行動心理療法）を送ることです。 この解決策の主な制限は、患者が治療に適応できないことです。

NAFLD は、単純な脂肪症から非アルコール性脂肪性肝炎 (NASH) までの幅広い組織学的スペクトルを包含します。 NASH は炎症を伴う脂肪症を特徴とし、欠損から肝硬変まで、さまざまな段階の線維症を呈する可能性があります。 線維症段階の診断と評価のゴールドスタンダードは、依然として肝生検です。 しかし、倫理的な理由と有効なスクリーニング方法ではないため、NAFLD が疑われるすべての患者に肝生検を実施することは不可能です。 したがって、スクリーニングおよび診断のための非侵襲的方法を開発する必要がある。 さらに、早期診断により、患者の慢性疾患に対する認識が高まり、ライフスタイルを変える動機が得られる可能性があります。

したがって、これを考慮すると、スクリーニングおよび診断のための非侵襲的な方法を開発する必要がある。 さらに、早期診断により、患者の慢性疾患に対する認識が高まり、ライフスタイルを変えるよう説得できる可能性があります。

新しいマーカーを特定することは、次の理由から非常に困難な作業になる可能性があることを考慮する必要があります。

生理病理学の複雑さ。 病気の進行には複数の要因が関与します。 他の多くの線維性疾患における共通のメディエーターの存在。 したがって、新しいバイオマーカーの発見を目的とした独自の戦略が基本的に重要です。 ハイスループット技術の発展のおかげで、今日ではオンライン データベースで大量のゲノムおよびプロテオミクス データに簡単にアクセスできるようになりました。 したがって、Cytoscape などのオープンソース ソフトウェアを使用して、インタラクトーム (細胞内のタンパク質間相互作用 -PPI-) を研究することが可能です。 このように、バイオインフォマティクスを使用すると、生物学的ネットワーク データをコンピュータで分析できるようになります。これは、高価な機器を必要とせずに、臨床的に関心のあるバイオマーカーを特定する方法となります。

客観的：

このプロジェクトの目的は、非侵襲的臨床検査で使用できる、NAFLD の診断と予後に有用な新しいバイオマーカーを (in silico 解析を通じて) 特定し、検証することです。

候補バイオマーカーを特定する際の私たちの最初のアプローチは、インシリコ研究で次の作業基準を使用することでした。

1. International Molecular Exchange (IMEx) コンソーシアムのガイドラインに準拠したデータベースから PPI データを取得します。
2. 表 1 にリストされているタンパク質 (最近の科学雑誌で NAFLD の診断の候補として提案されている) の生物学的ネットワークを構築します。
3. 筋線維芽細胞表現型の活性化/復帰を示す肝星細胞 (HSC) によって放出されるタンパク質の生物学的ネットワークを構築します (HSC は肝線維化に関与する主要な細胞です)。 表 1 を参照してください。
4. 私たちの研究には、HSC活性化の既知のマーカー（α-平滑筋アクチン、α-SMA）と細胞外マトリックス（ECM）の必須成分であるコラーゲンα-III I型（Col3A1）が含まれています。
5. 目的のタンパク質、つまり血清中に放出され、最も多くの生物学的ネットワークに接続するタンパク質を選択します。

表 1 - 文献に記載されている候補バイオマーカー タンパク質 関連情報 局在化 サイトケラチン 18 (CK-18) 肝細胞アポトーシスの指標。 NAFLD のバイオマーカーとして提案 細胞質、核 脂肪細胞脂肪酸結合タンパク質 (AFABP) NAFLD のバイオマーカーとして報告 細胞質 線維芽細胞成長因子 21 (FGF21) 肝臓および血清における発現の増加、脂肪変性の程度と相関 インスリン様増殖の放出因子結合タンパク質 3 (IGFBP-3) 最近の血清プロテオーム研究で NAFLD のバイオマーカーとして提案 分泌リンパ球サイトゾルタンパク質 1 (LCP1) アクチン結合タンパク質、NAFLD のバイオマーカーとして提案 細胞質、膜 ガレクチン-1 (LGALS1)活性化 HSC における発現の増加 分泌型ユビキチン結合因子 E4B (UBE4B) 活性化 HSC における発現の増加 細胞質、分泌型ビトロネクチン (VTN) 不活化 HSC における発現の増加 分泌型オステオポンチン (OPN) ECM の成分 分泌型ラミニン サブユニット ベータ 1 (LAMB1) の発現の減少不活化された HSC の分泌 α-SMA 活性化 HSC における発現の増加 細胞質 Col3A1 線維形成における生産の増加（細胞外マトリックスの成分） 分泌

記載された作業基準に基づき、Cytoscape を使用して、表 1 のタンパク質に対して作成された各 PPI ネットワーク (12 の生物学的ネットワーク) が共通の相互作用タンパク質 (共通のパートナー) を介して接続された、統合された生物学的ネットワーク (図 1) を取得しました。 これらの一般的なタンパク質、特に細胞によって放出されるタンパク質 (可溶性因子) がターゲットタンパク質になります。

予備的な分析から、潜在的なバイオマーカーとして次のタンパク質を特定しました:IGF-2 (インスリン様成長因子 2)、SPARC (酸性でシステインに富む分泌タンパク質)、EPICAN、および EGFR (上皮成長因子受容体) (強調表示)図 1 の赤色部分)。

実験計画

研究活動はイタリア肝臓財団で行われます。 サンプル収集はカッティナラ病院の一般外科で行われます。

記載された目的を達成するために、一般外科部門での肥満手術の候補者である患者のグループが参加します。 医療訪問が予定されており、その間に一般的な臨床情報が収集され、体重、身長、腹囲、血圧が測定されます。 ルーチンの術前準備および外来フォローアップの一環として、一般的な血液学的および生化学的パラメーター (全血球数、グルコース、インスリン、トリグリセリド、総コレステロール、HDL、トランスフェリン、フェリチン、血清鉄、C 反応性タンパク質)、肝臓機能（トランスアミナーゼ、アルブミン、総タンパク質）および腎機能（クレアチニン、尿中クレアチニン、微量アルブミン尿）は、血漿/血清サンプルの一般的な臨床検査を通じて評価されます。 収集されたサンプルの追加のアリコートは、RNA およびタンパク質の抽出とその後のサンプル品質の評価に使用されます。 診断調査や術前評価のために定期的に行われる採血では、穿刺部位に一時的な痛みが生じたり、あざ（血腫）が現れたりすることがあります。これは、採血の際に発生する可能性のある合併症です。

さらに、手術前に肝臓エラストメトリーが実行され、放射線検査の結果と検査結果を比較することができます。 超音波検査と同様の非侵襲的な検査です。 これらの調査は、予想される改善を定量化するために手術後 1 年後に繰り返され、採血のみが 6 か月後に繰り返されます。 どちらの手術も一般外科が担当します。

SICOB の国のガイドラインに従って肥満を対象に予定されている肥満手術では、皮下、肝臓、内臓脂肪の生検が行われます。 これらの生検では、手術時間が大幅に延長されることはありません。 これら 3 つのサンプルでは、​​研究対象のマーカーの存在と量が検証されます。 さらに、肝生検の一部は病理部門に送られ、線維化と脂肪症の程度を調べるための最終的な組織学的検査が行われます。 この研究のために収集・保存されたサンプルは、患者の健康状態を監視するために使用されます。 さらに、この研究の結果は、非アルコール性脂肪肝疾患の治療と予防の改善に貢献することで、他の患者にも役立つ可能性があります。

手術を予定している患者には、手術前に前述の手術、リスク、利点が記載されたインフォームドコンセント用紙が渡され、説明されます。

実験計画は 3 つのフェーズに分けることができます。

フェーズ 1: 綿密なインシリコ研究。 推定期間: 1 か月。

フェーズ 2: In vivo 研究、サンプル収集 (血液および肝臓)、サンプルバンク。 各患者の臨床データと検査データの収集。

RNA とタンパク質を抽出し、その後サンプルの品質を評価します。 バイオマーカーのパネルの mRNA 発現の定量化 (表 1 + 潜在的なバイオマーカー)。

ELISA/ウェスタンブロットを使用した候補バイオマーカーの血清および組織（肝臓）の定量化。

推定期間: 9 か月。

フェーズ 3: 結果の検証:

得られた結果は、臨床分析データ (血液値)、肝生検データ (病理組織学的データ)、およびカッティナラ病院で利用可能な画像技術 (超音波、エラストグラフィー) と関連付けられます。 新しいバイオマーカーと疾患の段階を相関付けるために統計分析が実行されます。

推定期間: 2 か月。

図 1: インシリコ研究。

サンプルサイズと統計分析:

この研究には、入院患者と外来患者の合計62人の患者の登録が計画されています。 サンプルサイズを計算するための基本的な式は次のとおりです。

N = (2 x (Zα + Zβ)2 x S2) / d2

N = 各サンプルグループの必須被験者。 グループ A (軽度の線維症の有無、ブラント: 0 ～ 1) とグループ B (中等度から重度の線維症、ブラント: 2 ～ 3) の 2 つのグループを設定しました。

Zα = 望ましいリスクの Z 値 (我々の場合、両側テストの場合は 1.96)。 Zβ = 望ましいリスクの Z 値 (我々の場合、両側テストでは 1.282)。 S2 = 対照または参照グループの定量的パラメーターの分散または分散 (当社の場合、参照グループ: グループ A、分散値 = 150 U/L)。

d = 検出可能な差異の最小値 (当社の場合、200 U/L)。

この手順を使用して計算された各グループのサンプル サイズは 29.3 です。 5% でのサンプル損失の可能性に対する補正を追加すると、合計は 30.87 になります。 サンプルの総数は 62 です。 文献で最も報告されているマーカーの 1 つ (CK-18) にこの分析を適用しました。 私たちの研究には 4 つのバイオマーカーの研究が含まれるため、マーカーのパネルを使用することで研究結果の可能性が高まる可能性があります (必要なサンプル数が削減される可能性があります)。

研究の有用性:

NAFLDなどの慢性肝疾患の分野では、診断と臨床予後を診断するための非侵襲的技術の特定と開発が緊急に必要とされています。 これらの方法は臨床上の意思決定の迅速化につながり、患者と医療スタッフの両方に利益をもたらします。 したがって、この研究から得られた結果は、NAFLD の診断、スクリーニング、治療を改善するための新しい血清バイオマーカーの同定と検証に貢献することを目的としています。 さらに、検証されたバイオマーカーは、炎症や線維化を伴って進行する他の肝疾患の予後マーカーとしても使用できることが期待されています。 非侵襲性バイオマーカーが利用可能になれば、線維症の進行率が高い人と、非増殖期に留まる可能性のある人、または寛解にさえ達する可能性のある人を区別することができ、臨床現場に即時に影響を与える可能性があります。 この情報は、治療のより正確な選択と有効性に貢献し、それによって全体的な患者の転帰を改善します。 さらに、特定のバイオマーカーの同定と、当施設に生物学的サンプルバンクが存在することにより、この状態だけでなく肝臓の他の線維形成プロセスにも関与する分子プロセスを徹底的に研究できる可能性がもたらされます。新しい薬理学的標的の特定。

提案された研究の観察的性質を考慮すると、通常の臨床診療にすでに提供されているもの以外に追加の保険契約は必要ありません。