Biomarker in der Diagnose und Prognose von NAFLD

Projektbeschreibung:

In der modernen Gesellschaft hat sich der Lebensstil mit dem Aufkommen der industriellen Entwicklung stark verändert, was zu ungesunden Gewohnheiten wie übermäßigem Essen und Fast-Food-Konsum (nach einer unausgewogenen Ernährung mit viel Zucker und Fetten) und verminderter körperlicher Aktivität geführt hat. In der Europäischen Union sind über die Hälfte der Erwachsenen übergewichtig oder fettleibig. Bei dieser Personengruppe besteht ein hohes Risiko für die Entwicklung chronischer Lebererkrankungen wie der nichtalkoholischen Fettlebererkrankung (NAFLD). Viele epidemiologische Berichte haben den Ausbruch von NAFLD mit einer falschen Ernährungsweise und sitzenden Gewohnheiten in Verbindung gebracht. Derzeit gibt es keine wirksamen pharmakologischen Therapien und die einzige Möglichkeit, die Erkrankung zu verhindern oder zu verbessern, ist ein gesünderer Lebensstil (individuelle Ernährung, körperliche Aktivität und kognitiv-verhaltensbezogene psychologische Therapien). Die Haupteinschränkung dieser Lösung ist die mangelnde Anpassungsfähigkeit des Patienten an die Therapie.

NAFLD umfasst ein breites histologisches Spektrum, das von der einfachen Steatose bis zur nichtalkoholischen Steatohepatitis (NASH) reicht. NASH ist durch Steatose mit Entzündung gekennzeichnet und kann verschiedene Stadien der Fibrose aufweisen, von nicht vorhanden bis zur Zirrhose. Der Goldstandard für die Diagnose und Beurteilung des Fibrosestadiums bleibt die Leberbiopsie. Allerdings ist die Durchführung einer Leberbiopsie bei jedem Patienten mit Verdacht auf NAFLD nicht möglich, sowohl aus ethischen Gründen als auch weil es sich nicht um eine gültige Screening-Methode handelt. Daher ist es notwendig, nicht-invasive Methoden für Screening und Diagnose zu entwickeln. Darüber hinaus könnte eine frühzeitige Diagnose das Bewusstsein der Patienten für ihre chronische Erkrankung schärfen und sie zu einer Änderung ihres Lebensstils motivieren.

Vor diesem Hintergrund ist es notwendig, nicht-invasive Methoden für Screening und Diagnose zu entwickeln. Darüber hinaus könnte eine frühzeitige Diagnose das Bewusstsein des Patienten für seine chronische Erkrankung schärfen und ihn davon überzeugen, seinen Lebensstil zu ändern.

Es sollte berücksichtigt werden, dass die Identifizierung neuer Marker aus folgenden Gründen eine sehr anspruchsvolle Aufgabe sein kann:

Komplexität der Physiopathologie. Mehrere Faktoren sind am Fortschreiten der Krankheit beteiligt. Vorhandensein gemeinsamer Mediatoren bei vielen anderen fibrotischen Erkrankungen. Daher ist eine originelle Strategie zur Entdeckung neuer Biomarker von grundlegender Bedeutung. Dank der Entwicklung von Hochdurchsatztechnologien sind heutzutage große Mengen genomischer und proteomischer Daten in Online-Datenbanken leicht zugänglich. Somit ist es möglich, das Interaktom (Protein-Protein-Wechselwirkungen (PPI) innerhalb einer Zelle) mithilfe von Open-Source-Software wie Cytoscape zu untersuchen. Auf diese Weise ermöglicht uns der Einsatz der Bioinformatik die Analyse biologischer Netzwerkdaten in silico, was eine Möglichkeit darstellt, Biomarker von klinischem Interesse zu identifizieren, ohne dass teure Geräte erforderlich sind.

Zielsetzung:

Ziel dieses Projekts ist die Identifizierung (durch In-silico-Analyse) und Validierung neuer Biomarker, die für die Diagnose und Prognose von NAFLD nützlich sind und in nicht-invasiven klinischen Tests verwendet werden können.

Unser erster Ansatz bei der Identifizierung möglicher Biomarker bestand darin, die folgenden Arbeitskriterien in In-silico-Studien zu verwenden:

1. Erhalten Sie PPI-Daten aus Datenbanken, die den Richtlinien des International Molecular Exchange (IMEx)-Konsortiums entsprechen.
2. Konstruieren Sie biologische Netzwerke für die in Tabelle 1 aufgeführten Proteine ​​(die in neueren wissenschaftlichen Fachzeitschriften als Kandidaten für die Diagnose von NAFLD vorgeschlagen wurden).
3. Konstruieren Sie biologische Netzwerke für Proteine, die von hepatischen Sternzellen (HSCs) freigesetzt werden, die eine Aktivierung/Reversion des myofibroblastischen Phänotyps anzeigen (HSCs sind die Hauptzellen, die an Leberfibrose beteiligt sind). Siehe Tabelle 1.
4. Beziehen Sie in unsere Studien den bekannten Marker der HSC-Aktivierung (α-Smooth Muscle Actin, α-SMA) und einen wesentlichen Bestandteil der extrazellulären Matrix (ECM) ein: Kollagen Alpha-III Typ I (Col3A1).
5. Wählen Sie Proteine ​​von Interesse aus, d. h. diejenigen, die im Serum freigesetzt werden und die die meisten biologischen Netzwerke verbinden.

Tabelle 1 – In der Literatur beschriebene Kandidaten-Biomarker Protein Relevante Informationen Lokalisierung Cytokeratin-18 (CK-18) Indikator für hepatozelluläre Apoptose. Vorgeschlagen als Biomarker im NAFLD-Zytoplasma, Zellkern Adipozyten-Fettsäure-bindendes Protein (AFABP) Als Biomarker im NAFLD-Zytoplasma gemeldet Fibroblasten-Wachstumsfaktor 21 (FGF21) Erhöhte Expression in Leber und Serum, korreliert mit dem Grad der Steatose. Freigesetztes insulinähnliches Wachstum Faktor-bindendes Protein 3 (IGFBP-3) Wird in einer aktuellen Studie zum Serumproteom als Biomarker für NAFLD vorgeschlagen. Sekretiertes zytosolisches Lymphozytenprotein 1 (LCP1) Aktin-bindendes Protein, vorgeschlagen als Biomarker für NAFLD Zytoplasma, Membran-Galectin-1 (LGALS1) Erhöhte Expression in aktivierten HSCs Sekretierter Ubiquitin-Konjugationsfaktor E4B (UBE4B) Erhöhte Expression in aktivierten HSCs Zytoplasma, sekretiertes Vitronectin (VTN) Erhöhte Expression in inaktivierten HSCs Sekretiertes Osteopontin (OPN) Komponente der ECM Sekretierte Laminin-Untereinheit Beta 1 (LAMB1) Reduzierte Expression in inaktivierte HSCs sekretierten α-SMA Erhöhte Expression in aktivierten HSCs Zytoplasma Col3A1 Erhöhte Produktion bei der Fibrogenese (Bestandteil der extrazellulären Matrix) Sekretiert

Basierend auf den beschriebenen Arbeitskriterien und unter Verwendung von Cytoscape haben wir ein integriertes biologisches Netzwerk erhalten (Abbildung 1), in dem jedes der für die Proteine ​​in Tabelle 1 erstellten PPI-Netzwerke (12 biologische Netzwerke) durch gemeinsame Interaktionsproteine ​​(gemeinsame Partner) verbunden war. Diese häufig vorkommenden Proteine, insbesondere die von Zellen freigesetzten (löslichen Faktoren), werden unsere Zielproteine ​​sein.

Aufgrund unserer vorläufigen Analyse haben wir die folgenden Proteine ​​als potenzielle Biomarker identifiziert: IGF-2 (insulinähnlicher Wachstumsfaktor 2), SPARC (sekretierter saurer und cysteinreicher Protein), EPICAN und EGFR (epidermaler Wachstumsfaktorrezeptor) (hervorgehoben). in rot in Abbildung 1).

Experimenteller Plan

Die Forschungsaktivitäten werden bei der Italian Liver Foundation durchgeführt. Die Probenentnahme findet in der Abteilung für Allgemeinchirurgie des Cattinara-Krankenhauses statt.

Um die beschriebenen Ziele zu erreichen, werden Gruppen von Patienten einbezogen, die für eine bariatrische Chirurgie an der Abteilung für Allgemeine Chirurgie in Frage kommen. Es ist ein Arztbesuch geplant, bei dem allgemeine klinische Informationen gesammelt und Gewicht, Größe, Taillenumfang und Blutdruck gemessen werden. Im Rahmen der routinemäßigen präoperativen Vorbereitung und ambulanten Nachsorge werden allgemeine hämatologische und biochemische Parameter (großes Blutbild, Glukose, Insulin, Triglyceride, Gesamtcholesterin, HDL, Transferrin, Ferritin, Serumeisen, C-reaktives Protein), Leber Funktion (Transaminasen, Albumin, Gesamtprotein) und Nierenfunktion (Kreatinin, Kreatinin im Urin, Mikroalbuminurie) werden durch gemeinsame Labortests an Plasma-/Serumproben bewertet. Ein zusätzlicher Aliquot der gesammelten Proben wird für die RNA- und Proteinextraktion und die anschließende Beurteilung der Probenqualität verwendet. Bei einer Blutentnahme, die routinemäßig für diagnostische Untersuchungen und präoperative Beurteilungen durchgeführt wird, kann es zu vorübergehenden Schmerzen an der Einstichstelle und dem Auftreten eines blauen Flecks (Hämatoms) kommen – Komplikationen, die bei jeder Blutentnahme auftreten können.

Darüber hinaus wird vor der Operation eine Leberelastometrie durchgeführt, die es uns ermöglicht, die radiologischen Ergebnisse mit den Laborergebnissen zu vergleichen. Dabei handelt es sich um eine nicht-invasive Untersuchung ähnlich einer Ultraschalluntersuchung. Diese Untersuchungen werden ein Jahr nach der Operation wiederholt, um die erwarteten Verbesserungen zu quantifizieren, während nur die Blutentnahme nach sechs Monaten wiederholt wird. Beide Eingriffe werden von der Abteilung für Allgemeinchirurgie übernommen.

Während der bariatrischen Operation, die gemäß den nationalen Richtlinien von SICOB bei Adipositas geplant ist, werden subkutane, Leber- und viszerale Fettbiopsien durchgeführt. Diese Biopsien verlängern die Operationszeit nicht wesentlich. In diesen drei Proben werden das Vorhandensein und die Menge der untersuchten Marker überprüft. Darüber hinaus wird ein Teil der Leberbiopsie zur endgültigen histologischen Untersuchung an die Pathologieabteilung geschickt, um den Grad der Fibrose und Steatose zu untersuchen. Die für diese Forschung gesammelten und konservierten Proben werden zur Überwachung des Gesundheitszustands des Patienten verwendet. Darüber hinaus könnten die Ergebnisse dieser Studie für andere Patienten hilfreich sein, indem sie zur Verbesserung der Behandlung und Prävention nichtalkoholischer Fettlebererkrankungen beitragen.

Dem für die Operation vorgesehenen Patienten wird vor dem Eingriff eine Einverständniserklärung ausgehändigt und erklärt, in der die oben genannten Verfahren, Risiken und Vorteile beschrieben werden.

Der Versuchsplan kann in drei Phasen unterteilt werden:

Phase 1: Eingehende In-silico-Studien. Geschätzte Zeit: 1 Monat.

Phase 2: In-vivo-Studien, Probenentnahme (Blut und Leber), Probenbank. Sammlung klinischer und Labordaten für jeden Patienten.

Extraktion von RNA und Proteinen, gefolgt von der Bewertung der Probenqualität. Quantifizierung der mRNA-Expression für das Biomarker-Panel (Tabelle 1 + potenzielle Biomarker).

Serum- und Gewebequantifizierung (Leber) von Kandidaten-Biomarkern mittels ELISA/Western Blot.

Geschätzte Zeit: 9 Monate.

Phase 3: Validierung der Ergebnisse:

Die erhaltenen Ergebnisse werden mit klinisch-analytischen Daten (Blutwerte), Leberbiopsiedaten (histopathologische Daten) und verfügbaren bildgebenden Verfahren (Ultraschall, Elastographie) im Cattinara Hospital korreliert. Es werden statistische Analysen durchgeführt, um die neuen Biomarker mit dem Krankheitsstadium zu korrelieren.

Geschätzte Zeit: 2 Monate.

Abbildung 1: In-silico-Studien.

Stichprobengröße und statistische Analyse:

Für die Studie ist die Aufnahme von insgesamt 62 stationären und ambulanten Patienten geplant. Die Grundgleichung zur Berechnung der Stichprobengröße lautet wie folgt:

N = (2 x (Zα + Zβ)2 x S2) / d2

N = erforderliche Probanden in jeder Stichprobengruppe. Wir haben zwei Gruppen gebildet: Gruppe A (ohne oder mit leichter Fibrose, Brunt: 0-1) und Gruppe B (mittelschwere bis schwere Fibrose, Brunt: 2-3).

Zα = Z-Wert für das gewünschte Risiko (bei uns beträgt er 1,96 für einen bilateralen Test). Zβ = Z-Wert für das gewünschte Risiko (bei uns beträgt er 1,282 für einen bilateralen Test). S2 = Varianz oder Streuung des quantitativen Parameters für die Kontroll- oder Referenzgruppe (für uns Referenzgruppe: Gruppe A, Streuungswert = 150 U/L).

d = Minimalwert der nachweisbaren Differenz (für uns 200 U/L).

Die mit diesem Verfahren berechnete Stichprobengröße für jede Gruppe beträgt 29,3. Wenn man eine Korrektur für die Möglichkeit eines Probenverlusts bei 5 % hinzufügt, ergibt sich ein Gesamtwert von 30,87. Die Gesamtzahl der Proben beträgt 62. Wir haben diese Analyse auf einen der Marker in der Studie (CK-18) angewendet, da dieser in der Literatur am häufigsten beschrieben wird. Da unsere Studie die Untersuchung von 4 Biomarkern umfasst, ist es möglich, dass die Arbeit mit einer Gruppe von Markern die Wahrscheinlichkeit von Studienergebnissen erhöht (und möglicherweise die erforderliche Anzahl von Proben verringert).

Nutzen der Studie:

Im Bereich chronischer Lebererkrankungen wie NAFLD besteht ein dringender Bedarf an der Identifizierung und Entwicklung nicht-invasiver Techniken zur Diagnose und klinischen Prognose. Diese Methoden werden zu einer schnelleren klinischen Entscheidungsfindung führen, was sowohl den Patienten als auch dem medizinischen Personal zugute kommt. Daher sollen die Ergebnisse dieser Studie zur Identifizierung und Validierung neuer Serumbiomarker beitragen, um die Diagnose, das Screening und die Behandlung von NAFLD zu verbessern. Darüber hinaus besteht die Hoffnung, dass die validierten Biomarker auch als prognostische Marker bei anderen Lebererkrankungen eingesetzt werden können, die mit Entzündungen und Fibrose fortschreiten. Die Verfügbarkeit nicht-invasiver Biomarker hätte unmittelbare Auswirkungen auf die klinische Praxis und würde zwischen Personen mit einer hohen Fibrose-Progressionsrate und solchen unterscheiden, die möglicherweise in einer nicht-proliferativen Phase verbleiben oder sogar eine Remission erreichen. Diese Informationen würden zu einer genaueren Auswahl und Wirksamkeit der Therapie beitragen und dadurch das Gesamtergebnis für den Patienten verbessern. Darüber hinaus bietet die Identifizierung spezifischer Biomarker zusammen mit dem Vorhandensein einer biologischen Probenbank in unserer Einrichtung die Möglichkeit, die molekularen Prozesse, die nicht nur bei dieser Erkrankung, sondern auch bei anderen fibrogenen Prozessen in der Leber eine Rolle spielen, gründlich zu untersuchen Identifizierung neuer pharmakologischer Ziele.

Aufgrund des Beobachtungscharakters der vorgeschlagenen Studie sind keine zusätzlichen Versicherungspolicen erforderlich, die über die bereits für die normale klinische Praxis bereitgestellten Versicherungspolicen hinausgehen.