Biomarkery w diagnostyce i rokowaniu NAFLD

Opis Projektu:

We współczesnym społeczeństwie, wraz z pojawieniem się rozwoju przemysłu, styl życia uległ znacznej modyfikacji, co doprowadziło do niezdrowych nawyków, takich jak objadanie się i spożywanie fast foodów (po niezbilansowanej diecie bogatej w cukry i tłuszcze) oraz zmniejszonej aktywności fizycznej. W Unii Europejskiej ponad połowa dorosłych ma nadwagę lub otyłość. Uważa się, że tę grupę osób należy do grupy wysokiego ryzyka rozwoju przewlekłych chorób wątroby, takich jak niealkoholowa stłuszczeniowa choroba wątroby (NAFLD). Wiele raportów epidemiologicznych wiąże początek NAFLD ze złymi wyborami żywieniowymi i siedzącym trybem życia. Obecnie nie ma skutecznych terapii farmakologicznych, a jedynym sposobem zapobiegania lub poprawy schorzenia jest prowadzenie zdrowszego trybu życia (spersonalizowane diety, aktywność fizyczna i terapie psychologiczne poznawczo-behawioralne). Głównym ograniczeniem tego rozwiązania jest brak możliwości przystosowania się pacjenta do terapii.

NAFLD obejmuje szerokie spektrum histologiczne, od prostego stłuszczenia do niealkoholowego stłuszczeniowego zapalenia wątroby (NASH). NASH charakteryzuje się stłuszczeniem z zapaleniem i może występować w różnych stadiach zwłóknienia, od braku do marskości. Złotym standardem w diagnostyce i ocenie stopnia zwłóknienia pozostaje biopsja wątroby. Jednakże wykonanie biopsji wątroby u każdego pacjenta z podejrzeniem NAFLD jest niemożliwe zarówno ze względów etycznych, jak i dlatego, że nie jest to ważna metoda przesiewowa. Dlatego też konieczne jest opracowanie nieinwazyjnych metod badań przesiewowych i diagnostyki. Ponadto wczesna diagnoza może zwiększyć świadomość pacjentów na temat ich choroby przewlekłej i zmotywować ich do zmiany stylu życia.

Biorąc to pod uwagę, konieczne jest opracowanie nieinwazyjnych metod badań przesiewowych i diagnostyki. Co więcej, wczesna diagnoza mogłaby zwiększyć świadomość pacjenta na temat jego przewlekłej choroby i przekonać go do zmiany stylu życia.

Należy wziąć pod uwagę, że identyfikacja nowych markerów może być bardzo trudnym zadaniem ze względu na:

Złożoność fizjopatologii. Wiele czynników wpływa na postęp choroby. Obecność wspólnych mediatorów w wielu innych zaburzeniach zwłóknieniowych. Dlatego fundamentalne znaczenie ma oryginalna strategia mająca na celu odkrycie nowych biomarkerów. Dzięki rozwojowi technologii o dużej przepustowości, obecnie ogromna ilość danych genomowych i proteomicznych jest łatwo dostępna w internetowych bazach danych. Możliwe jest zatem badanie interakcji (interakcji białko-białko -PPI- w komórce) przy użyciu oprogramowania typu open source, takiego jak Cytoscape. W ten sposób wykorzystanie bioinformatyki pozwala nam analizować dane z sieci biologicznej in silico, co stanowi sposób identyfikacji biomarkerów o znaczeniu klinicznym bez konieczności stosowania drogiego sprzętu.

Cel:

Celem tego projektu jest identyfikacja (poprzez analizę in silico) i walidacja nowych biomarkerów przydatnych w diagnostyce i prognozowaniu NAFLD, które można wykorzystać w nieinwazyjnych testach klinicznych.

Nasze początkowe podejście do identyfikacji potencjalnych biomarkerów polegało na zastosowaniu następujących kryteriów roboczych w badaniach in silico:

1. Uzyskaj dane PPI z baz danych zgodnych z wytycznymi konsorcjum Międzynarodowej Wymiany Molekularnej (IMEx).
2. Skonstruuj sieci biologiczne dla białek wymienionych w tabeli 1 (które w ostatnich czasopismach naukowych zaproponowano jako kandydatów do diagnozy NAFLD).
3. Konstruuj sieci biologiczne dla białek uwalnianych przez komórki gwiaździste wątroby (HSC), które wskazują na aktywację/odwrócenie fenotypu miofibroblastycznego (HSC to główne komórki zaangażowane w zwłóknienie wątroby). Zobacz tabelę 1.
4. Do naszych badań włączyliśmy znany marker aktywacji HSC (α-aktyna mięśni gładkich, α-SMA) oraz niezbędny składnik macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM): kolagen alfa-III typu I (Col3A1).
5. Wybierz białka, które Cię interesują, czyli takie, które uwalniają się w surowicy i łączą największą liczbę sieci biologicznych.

Tabela 1 – Kandydaci na biomarkery opisane w literaturze Białko Istotne informacje Lokalizacja Cytokeratyna-18 (CK-18) Wskaźnik apoptozy komórek wątrobowych. Proponowany jako biomarker w NAFLD Cytoplazma, jądro Adipocytowe białko wiążące kwasy tłuszczowe (AFABP) Zgłaszany jako biomarker w NAFLD Cytoplazma Czynnik wzrostu fibroblastów 21 (FGF21) Zwiększona ekspresja w wątrobie i surowicy, skorelowana ze stopniem stłuszczenia Uwolniony wzrost insulinopodobny białko wiążące czynnik 3 (IGFBP-3) Proponowane jako biomarker NAFLD w niedawnym badaniu proteomu w surowicy Białko cytozolowe 1 wydzielanych limfocytów (LCP1) Białko wiążące aktynę, sugerowane jako biomarker NAFLD Cytoplazma, błona Galektyna-1 (LGALS1) Zwiększona ekspresja w aktywowanych HSC Wydzielany czynnik koniugacji ubikwityny E4B (UBE4B) Zwiększona ekspresja w aktywowanych HSC Cytoplazma, wydzielana witronektyna (VTN) Zwiększona ekspresja w inaktywowanych HSC Wydzielana osteopontyna (OPN) Składnik ECM podjednostki beta 1 wydzielanej lamininy (LAMB1) Zmniejszona ekspresja w inaktywowane HSC Wydzielane α-SMA Zwiększona ekspresja w aktywowanych HSC Cytoplazma Col3A1 Zwiększona produkcja w procesie fibrogenezy (składnik macierzy zewnątrzkomórkowej) Wydzielany

W oparciu o opisane kryteria pracy i przy użyciu Cytoscape otrzymaliśmy zintegrowaną sieć biologiczną (ryc. 1), w której każda z sieci PPI utworzonych dla białek z Tabeli 1 (12 sieci biologicznych) została połączona poprzez wspólne białka interakcji (wspólni partnerzy). Te powszechne białka, szczególnie te uwalniane przez komórki (czynniki rozpuszczalne), będą naszymi białkami docelowymi.

Na podstawie naszej wstępnej analizy zidentyfikowaliśmy następujące białka jako potencjalne biomarkery: IGF-2 (insulinopodobny czynnik wzrostu 2), SPARC (wydzielane białko kwasowe i bogate w cysteinę), EPICAN i EGFR (receptor naskórkowego czynnika wzrostu) (podkreślone na czerwono na rysunku 1).

Plan eksperymentalny

Działania badawcze będą prowadzone w Italian Liver Foundation. Pobranie próbki odbędzie się na Oddziale Chirurgii Ogólnej szpitala Cattinara.

Do osiągnięcia opisanych celów zaangażowane zostaną grupy pacjentów kandydatów do operacji bariatrycznej na Oddziale Chirurgii Ogólnej. Zaplanowana jest wizyta lekarska, podczas której zostaną zebrane ogólne informacje kliniczne oraz dokonane zostaną pomiary masy ciała, wzrostu, obwodu talii i ciśnienia krwi. W ramach rutynowych przygotowań przedoperacyjnych i kontroli ambulatoryjnej należy badać ogólne parametry hematologiczne i biochemiczne (morfologia krwi, glukoza, insulina, trójglicerydy, cholesterol całkowity, HDL, transferyna, ferrytyna, żelazo w surowicy, białko C-reaktywne), wątroba czynność nerek (transaminazy, albuminy, białko całkowite) i czynność nerek (kreatynina, kreatynina w moczu, mikroalbuminuria) zostaną ocenione za pomocą typowych testów laboratoryjnych na próbkach osocza/surowicy. Dodatkowa porcja pobranych próbek zostanie wykorzystana do ekstrakcji RNA i białek, a następnie oceny jakości próbki. Pobranie krwi, które jest rutynowo wykonywane w celu badań diagnostycznych i oceny przedoperacyjnej, może wiązać się z chwilowym bólem w miejscu nakłucia i pojawieniem się siniaka (krwiaka), co może wystąpić po pobraniu krwi.

Ponadto przed zabiegiem zostanie wykonana elastometria wątroby, która umożliwi porównanie wyników radiologicznych z wynikami badań laboratoryjnych. Jest to badanie nieinwazyjne, podobne do USG. Badania te zostaną powtórzone po roku od operacji, aby określić ilościowo oczekiwaną poprawę, natomiast po sześciu miesiącach powtórzone zostanie jedynie pobieranie krwi. Obydwa zabiegi będą pokrywane przez Oddział Chirurgii Ogólnej.

Podczas operacji bariatrycznej, która zgodnie z krajowymi wytycznymi SICOB jest planowana z powodu otyłości, zostaną wykonane biopsje tkanki tłuszczowej podskórnej, wątroby i trzewnej. Biopsje te nie wydłużają znacząco czasu operacji. W tych trzech próbach zostanie zweryfikowana obecność i ilość badanych markerów. Dodatkowo część biopsji wątroby zostanie przesłana do oddziału patologii w celu ostatecznego badania histologicznego w celu określenia stopnia zwłóknienia i stłuszczenia. Pobrane i zakonserwowane próbki do badań posłużą do monitorowania stanu zdrowia pacjenta. Ponadto wyniki tego badania mogą być pomocne dla innych pacjentów, przyczyniając się do poprawy leczenia i zapobiegania niealkoholowej stłuszczeniowej chorobie wątroby.

Pacjentowi zaplanowanemu na operację zostanie przekazany i wyjaśniony przed zabiegiem formularz świadomej zgody, w którym opisane są wyżej wymienione procedury, ryzyko i korzyści.

Plan eksperymentu można podzielić na trzy fazy:

Faza 1: Dogłębne badania in silico. Szacowany czas: 1 miesiąc.

Faza 2: Badania in vivo, pobranie próbek (krew i wątroba), bank próbek. Gromadzenie danych klinicznych i laboratoryjnych dla każdego pacjenta.

Ekstrakcja RNA i białek, a następnie ocena jakości próbki. Kwantyfikacja ekspresji mRNA dla panelu biomarkerów (Tabela 1 + potencjalne biomarkery).

Kwantyfikacja potencjalnych biomarkerów w surowicy i tkankach (wątrobie) za pomocą testu ELISA/Western blot.

Szacowany czas: 9 miesięcy.

Faza 3: Walidacja wyników:

Uzyskane wyniki zostaną skorelowane z danymi kliniczno-analitycznymi (wartości krwi), danymi z biopsji wątroby (dane histopatologiczne) i dostępnymi technikami obrazowania (USG, elastografia) w szpitalu Cattinara. Przeprowadzona zostanie analiza statystyczna w celu powiązania nowych biomarkerów ze stopniem zaawansowania choroby.

Szacowany czas: 2 miesiące.

Rysunek 1: Badania in silico.

Wielkość próby i analiza statystyczna:

Do badania planuje się włączyć ogółem 62 pacjentów, zarówno pacjentów hospitalizowanych, jak i ambulatoryjnych. Podstawowe równanie służące do obliczania wielkości próby jest następujące:

N = (2 x (Zα + Zβ)2 x S2) / d2

N = wymagane przedmioty w każdej próbnej grupie. Ustaliliśmy dwie grupy: Grupę A (bez lub z łagodnym zwłóknieniem, Brunt: 0-1) i Grupę B (zwłóknienie umiarkowane do ciężkiego, Brunt: 2-3).

Zα = wartość Z dla pożądanego ryzyka (dla nas jest to 1,96 dla testu obustronnego). Zβ = wartość Z dla pożądanego ryzyka (dla nas jest to 1,282 dla testu dwustronnego). S2 = Wariancja lub rozrzut parametru ilościowego dla grupy kontrolnej lub referencyjnej (dla nas grupa referencyjna: Grupa A, wartość rozproszenia = 150 U/L).

d = Minimalna wartość wykrywalnej różnicy (dla nas 200 U/L).

Obliczona wielkość próby dla każdej grupy przy zastosowaniu tej procedury wynosi 29,3. Dodanie poprawki na możliwość utraty próbki na poziomie 5% daje w sumie 30,87. Całkowita liczba próbek wynosi 62. Zastosowaliśmy tę analizę do jednego z markerów w badaniu (CK-18), ponieważ jest on najczęściej opisywany w literaturze. Ponieważ nasze badanie obejmuje badanie 4 biomarkerów, możliwe jest, że praca z panelem markerów zwiększy prawdopodobieństwo uzyskania wyników badania (potencjalnie zmniejszając wymaganą liczbę próbek).

Użyteczność badania:

W dziedzinie przewlekłych chorób wątroby, takich jak NAFLD, istnieje pilna potrzeba identyfikacji i rozwoju nieinwazyjnych technik diagnozowania i prognozowania klinicznego. Metody te pozwolą na szybsze podejmowanie decyzji klinicznych, z korzyścią zarówno dla pacjentów, jak i personelu medycznego. Dlatego też wyniki uzyskane w tym badaniu mają na celu przyczynienie się do identyfikacji i walidacji nowych biomarkerów w surowicy w celu poprawy diagnostyki, badań przesiewowych i leczenia NAFLD. Ponadto istnieje nadzieja, że ​​zatwierdzone biomarkery będą mogły być również stosowane jako markery prognostyczne w innych chorobach wątroby, które postępują wraz ze stanem zapalnym i zwłóknieniem. Dostępność nieinwazyjnych biomarkerów miałaby natychmiastowy wpływ na praktykę kliniczną, umożliwiając rozróżnienie osób z wysokim stopniem progresji zwłóknienia od tych, które mogą pozostać w fazie nieproliferacyjnej lub nawet osiągnąć remisję. Informacje te przyczyniłyby się do dokładniejszego doboru i skuteczności terapii, poprawiając w ten sposób ogólny wynik leczenia pacjenta. Dodatkowo identyfikacja specyficznych biomarkerów, wraz z obecnością w naszej instytucji banku próbek biologicznych, daje potencjał do dokładnego zbadania procesów molekularnych zachodzących nie tylko w tej chorobie, ale także w innych procesach fibrogenicznych w wątrobie, z możliwością identyfikacja nowych celów farmakologicznych.

Biorąc pod uwagę obserwacyjny charakter proponowanego badania, nie są wymagane żadne dodatkowe polisy ubezpieczeniowe poza tymi, które są już przewidziane w normalnej praktyce klinicznej.