Biomarkkerit NAFLD:n diagnosoinnissa ja ennusteessa

Hankkeen kuvaus:

Nyky-yhteiskunnassa teollisen kehityksen myötä elämäntapa on muuttunut suuresti, mikä on johtanut epäterveellisiin tottumuksiin, kuten ylensyömiseen ja pikaruoan kulutukseen (epätasapainoisen sokeri- ja rasvapitoisen ruokavalion noudattaminen) ja fyysisen aktiivisuuden vähenemiseen. Euroopan unionissa yli puolet aikuisista on ylipainoisia tai lihavia. Tällä yksilöryhmällä katsotaan olevan suuri riski sairastua kroonisiin maksasairauksiin, kuten alkoholittomaan rasvamaksatautiin (NAFLD). Monet epidemiologiset raportit ovat yhdistäneet NAFLD:n puhkeamisen huonoihin ruokavaliovalintoihin ja istumistottumuksiin. Tällä hetkellä ei ole olemassa tehokkaita lääkehoitoja, ja ainoa tapa ehkäistä tai parantaa tilaa on noudattamalla terveellisempiä elämäntapoja (henkilökohtaiset ruokavaliot, fyysinen aktiivisuus ja kognitiivis-käyttäytymispsykologiset terapiat). Tämän ratkaisun tärkein rajoitus on potilaan sopeutumiskyvyn puute hoitoon.

NAFLD kattaa laajan histologisen kirjon yksinkertaisesta steatoosista alkoholittomaan steatohepatiittiin (NASH). NASH:lle on ominaista steatoosi, johon liittyy tulehdus, ja se voi esiintyä fibroosin eri vaiheissa poissaolosta kirroosiin. Kultastandardi fibroosivaiheen diagnosoinnissa ja arvioinnissa on edelleen maksabiopsia. Maksabiopsian tekeminen jokaiselle epäillylle NAFLD-potilaalle on kuitenkin mahdotonta sekä eettisistä syistä että koska se ei ole kelvollinen seulontamenetelmä. Siksi on tarpeen kehittää ei-invasiivisia menetelmiä seulonta- ja diagnoosimenetelmiä varten. Lisäksi varhainen diagnoosi voisi lisätä potilaiden tietoisuutta kroonisesta sairaudestaan ​​ja motivoida heitä muuttamaan elämäntapaansa.

Tämän vuoksi on tarpeen kehittää ei-invasiivisia menetelmiä seulonta- ja diagnoosimenetelmiä varten. Lisäksi varhainen diagnoosi voisi lisätä potilaan tietoisuutta kroonisesta sairaudestaan ​​ja saada hänet muuttamaan elämäntapaansa.

On otettava huomioon, että uusien merkkien tunnistaminen voi olla erittäin haastava tehtävä johtuen:

Fysiopatologian monimutkaisuus. Useat tekijät vaikuttavat taudin etenemiseen. Yleisten välittäjien esiintyminen monissa muissa fibroottisissa sairauksissa. Siksi alkuperäinen strategia, jonka tavoitteena on löytää uusia biomarkkereita, on erittäin tärkeä. Suorituskykyisten teknologioiden kehityksen ansiosta valtava määrä genomista ja proteomista dataa on nykyään helposti saatavilla online-tietokannoista. Siten on mahdollista tutkia interaktomia (proteiini-proteiini-vuorovaikutuksia -PPI-solun sisällä) käyttämällä avoimen lähdekoodin ohjelmistoja, kuten Cytoscape. Tällä tavoin bioinformatiikan avulla voimme analysoida in silico -biologisen verkon tietoja, mikä on tapa tunnistaa kliinisesti kiinnostavia biomarkkereita ilman kalliita laitteita.

Tavoite:

Tämän projektin tavoitteena on tunnistaa (in silico -analyysin avulla) ja validoida uusia biomarkkereita, jotka ovat hyödyllisiä NAFLD:n diagnosoinnissa ja ennustamisessa ja joita voidaan käyttää ei-invasiivisissa kliinisissä testeissä.

Alkuperäinen lähestymistapamme biomarkkeriehdokkaiden tunnistamisessa oli käyttää seuraavia työkriteereitä in silico -tutkimuksissa:

1. Hanki PPI-tiedot tietokannoista, jotka noudattavat International Molecular Exchange (IMEx) -konsortion ohjeita.
2. Rakenna biologisia verkkoja taulukossa 1 luetelluille proteiineille (joita on ehdotettu ehdokkaiksi NAFLD:n diagnosointiin viimeaikaisissa tieteellisissä julkaisuissa).
3. Rakenna biologisia verkkoja maksan tähtisolujen (HSC:t) vapauttamille proteiineille, jotka osoittavat myofibroblastisen fenotyypin aktivoitumisen/palautumisen (HSC:t ovat pääasiallisia maksafibroosiin osallistuvia soluja). Katso taulukko 1.
4. Sisällytä tutkimuksiimme tunnettu HSC-aktivaation merkkiaine (α-sileänlihaksen aktiini, α-SMA) ja solunulkoisen matriisin (ECM) olennainen komponentti: kollageeni alfa-III tyyppi I (Col3A1).
5. Valitse mielenkiinnon kohteena olevat proteiinit, eli ne, jotka vapautuvat seerumissa ja jotka yhdistävät suurimman määrän biologisia verkostoja.

Taulukko 1 - Kirjallisuudessa kuvatut ehdokasbiomarkkerit Proteiini Asiaankuuluvat tiedot Lokalisaatio Sytokeratiini-18 (CK-18) Maksasolujen apoptoosin indikaattori. Ehdotettu biomarkkeriksi NAFLD:n sytoplasmassa, tumassa Adiposyyttien rasvahappoja sitova proteiini (AFABP) Raportoitu biomarkkeriksi NAFLD:n sytoplasmassa Fibroblastikasvutekijä 21 (FGF21) Lisääntynyt ekspressio maksassa ja seerumissa, korreloi steatoosin asteen kanssa Vapautunut insuliinin kaltainen kasvu tekijää sitova proteiini 3 (IGFBP-3) Ehdotettu biomarkkeriksi NAFLD:lle äskettäisessä seerumin proteomitutkimuksessa. Erittynyt lymfosyyttien sytosoliproteiini 1 (LCP1) Aktiinia sitova proteiini, ehdotettu biomarkkeriksi NAFLD:n sytoplasmassa, kalvo Galectin-1 (LGALS1) Lisääntynyt ekspressio aktivoiduissa HSC:issä Erittynyt ubikitiinikonjugaatiotekijä E4B (UBE4B) Lisääntynyt ekspressio aktivoiduissa HSC:issä Sytoplasmassa, erittynyt vitronektiini (VTN) Lisääntynyt ekspressio inaktivoiduissa HSC:issä Erittynyt osteopontiini (OPN) ECM:n komponentti Erittynyt Laminiini 1 ReducetLAMB:n ilmentyminen inaktivoidut HSC:t Erittyvät α-SMA Lisääntynyt ekspressio aktivoiduissa HSC:issä Sytoplasma Col3A1 Lisääntynyt tuotanto fibrogeneesissä (sellulaarisen matriisin komponentti) Erittynyt

Kuvattujen työskentelykriteerien perusteella ja Cytoscapea käyttämällä saatiin integroitu biologinen verkko (kuva 1), jossa jokainen taulukon 1 proteiineille luoduista PPI-verkoista (12 biologista verkkoa) oli yhdistetty yhteisten vuorovaikutusproteiinien (yhteiset partnerit) kautta. Nämä yleiset proteiinit, erityisesti solujen vapauttamat (liukoiset tekijät), ovat kohdeproteiinejamme.

Alustavan analyysin perusteella olemme tunnistaneet seuraavat proteiinit mahdollisiksi biomarkkeriksi: IGF-2 (insuliinin kaltainen kasvutekijä 2), SPARC (eritetty proteiini, hapan ja runsaasti kysteiiniä), EPICAN ja EGFR (epidermaalisen kasvutekijän reseptori) (korostettu punaisella kuvassa 1).

Kokeellinen suunnitelma

Tutkimustoimintaa tehdään Italian Maksasäätiössä. Näytteenotto tapahtuu Cattinaran sairaalan yleiskirurgian osastolla.

Kuvattujen tavoitteiden saavuttamiseksi mukaan otetaan yleiskirurgian yksikön bariatriseen kirurgiaan hakeutuvia potilasryhmiä. Suunniteltu lääkärinkäynti, jonka aikana kerätään yleistä kliinistä tietoa ja mitataan paino, pituus, vyötärön ympärysmitta ja verenpaine. Osana rutiininomaista leikkausta edeltävää valmistelua ja avohoitoa, yleiset hematologiset ja biokemialliset parametrit (täydellinen verenkuva, glukoosi, insuliini, triglyseridit, kokonaiskolesteroli, HDL, transferriini, ferritiini, seerumin rauta, C-reaktiivinen proteiini), maksa toiminta (transaminaasit, albumiini, kokonaisproteiini) ja munuaisten toiminta (kreatiniini, virtsan kreatiniini, mikroalbuminuria) arvioidaan yleisillä plasma-/seeruminäytteiden laboratoriotesteillä. Kerättyjen näytteiden lisäerä käytetään RNA:n ja proteiinin uuttamiseen ja myöhempään näytteen laadun arviointiin. Verenotto, joka tehdään rutiininomaisesti diagnostisia tutkimuksia ja preoperatiivista arviointia varten, voi sisältää hetkellistä kipua pistoskohdassa ja mustelman (hematooman) ilmaantumista, komplikaatioita, joita voi esiintyä minkä tahansa verenoton yhteydessä.

Lisäksi ennen leikkausta tehdään maksan elastometria, jonka avulla voimme verrata radiologisia tuloksia laboratoriotuloksiin. Tämä on ei-invasiivinen tutkimus, joka muistuttaa ultraääntä. Nämä tutkimukset toistetaan vuoden kuluttua leikkauksesta odotettujen parannusten kvantifioimiseksi, kun taas vain verenotto toistetaan kuuden kuukauden kuluttua. Molemmat toimenpiteet kuuluvat yleiskirurgian osastolle.

Bariatrisen leikkauksen aikana, joka on suunniteltu liikalihavuuden vuoksi SICOB:n kansallisten ohjeiden mukaan, tehdään ihonalaisia, maksa- ja sisäelinten rasvakudoksia. Nämä biopsiat eivät merkittävästi pidennä leikkausaikoja. Näissä kolmessa näytteessä tutkittujen merkkiaineiden läsnäolo ja määrä varmistetaan. Lisäksi osa maksan biopsiasta lähetetään patologian osastolle lopulliseen histologiseen tutkimukseen fibroosin ja steatoosin asteen selvittämiseksi. Tätä tutkimusta varten kerättyjä ja säilytettyjä näytteitä käytetään potilaan terveydentilan seurantaan. Lisäksi tämän tutkimuksen tuloksista voi olla apua muille potilaille, koska ne edistävät alkoholittoman rasvamaksasairauden hoitoa ja ehkäisyä.

Leikkaukseen varatulle potilaalle annetaan ja selitetään ennen toimenpidettä tietoinen suostumuslomake, jossa on kuvattu edellä mainitut toimenpiteet, riskit ja hyödyt.

Kokeilusuunnitelma voidaan jakaa kolmeen vaiheeseen:

Vaihe 1: Syvälliset in silico -tutkimukset. Arvioitu aika: 1 kuukausi.

Vaihe 2: In vivo -tutkimukset, näytteenotto (veri ja maksa), näytepankki. Kliinisten ja laboratoriotietojen kerääminen jokaisesta potilaasta.

RNA:n ja proteiinien uuttaminen, jonka jälkeen näytteen laadun arviointi. mRNA:n ilmentymisen kvantifiointi biomarkkerien paneelille (taulukko 1 + mahdolliset biomarkkerit).

Ehdokasbiomarkkerien seerumin ja kudoksen (maksa) kvantifiointi ELISA/Western blot -menetelmällä.

Arvioitu aika: 9 kuukautta.

Vaihe 3: Tulosten validointi:

Saadut tulokset korreloidaan kliinis-analyyttisten tietojen (veriarvot), maksan biopsiatietojen (histopatologiset tiedot) ja Cattinaran sairaalassa käytettävissä olevien kuvantamistekniikoiden (ultraääni, elastografia) kanssa. Tilastollinen analyysi tehdään uusien biomarkkerien korreloimiseksi taudin vaiheeseen.

Arvioitu aika: 2 kuukautta.

Kuva 1: In silico -tutkimukset.

Otoskoko ja tilastollinen analyysi:

Tutkimukseen suunnitellaan ottavan yhteensä 62 potilasta sekä avo- että avohoidossa. Otoskoon laskemisen perusyhtälö on seuraava:

N = (2 x (Za + Zp)2 x S2) / d2

N = pakolliset aiheet kussakin näyteryhmässä. Perustimme kaksi ryhmää: ryhmä A (ilman fibroosia tai lievää fibroosia, Brunt: 0-1) ja ryhmä B (kohtalainen tai vaikea fibroosi, Brunt: 2-3).

Zα = halutun riskin Z-arvo (meillä se on 1,96 kahdenvälisessä testissä). Zβ = halutun riskin Z-arvo (meillä se on 1,282 kahdenvälisessä testissä). S2 = Kontrolli- tai vertailuryhmän kvantitatiivisen parametrin varianssi tai dispersio (meillä vertailuryhmä: ryhmä A, dispersioarvo = 150 U/L).

d = havaittavan eron vähimmäisarvo (meille 200 U/L).

Laskettu otoskoko kullekin ryhmälle tätä menettelyä käyttäen on 29,3. Kun lisätään korjaus mahdolliseen näytehäviöön 5 %:lla, saadaan yhteensä 30,87. Näytteiden kokonaismäärä on 62. Sovellimme tätä analyysiä yhteen tutkimuksen markkereista (CK-18), koska se on kirjallisuudessa eniten raportoitu. Koska tutkimuksemme sisältää neljän biomarkkerin tutkimuksen, on mahdollista, että työskentely markkeripaneelin kanssa lisää tutkimustulosten todennäköisyyttä (mahdollisesti vähentää tarvittavaa näytteiden määrää).

Tutkimuksen hyödyllisyys:

Kroonisten maksasairauksien, kuten NAFLD:n, alalla on kiireellinen tarve tunnistaa ja kehittää ei-invasiivisia tekniikoita diagnoosia ja kliinistä ennustetta varten. Nämä menetelmät johtavat nopeampaan kliiniseen päätöksentekoon, mikä hyödyttää sekä potilaita että hoitohenkilökuntaa. Tästä syystä tästä tutkimuksesta saadut tulokset pyrkivät edistämään uusien seerumin biomarkkerien tunnistamista ja validointia NAFLD:n diagnoosin, seulonnan ja hoidon parantamiseksi. Lisäksi toivotaan, että validoituja biomarkkereita voidaan käyttää prognostisina markkereina myös muissa tulehduksilla ja fibroosilla etenevässä maksasairaudessa. Ei-invasiivisten biomarkkerien saatavuudella olisi välitön vaikutus kliiniseen käytäntöön, jolloin erotettaisiin yksilöt, joilla on korkea fibroosin etenemisaste, ja ne, jotka saattavat jäädä ei-proliferatiiviseen vaiheeseen tai jopa saavuttaa remission. Nämä tiedot edistäisivät hoidon tarkempaa valintaa ja tehokkuutta, mikä parantaa potilaan kokonaistulosta. Lisäksi spesifisten biomarkkerien tunnistaminen sekä biologisen näytepankin läsnäolo laitoksessamme tarjoaa mahdollisuuden tutkia perusteellisesti molekyyliprosesseja, jotka liittyvät paitsi tähän tilaan, myös muihin maksan fibrogeenisiin prosesseihin. uusien farmakologisten kohteiden tunnistaminen.

Koska ehdotettu tutkimus on havainnollistava, muita vakuutuksia ei tarvita normaaliin kliiniseen käytäntöön jo annettujen vakuutusten lisäksi.