Biomarkører i diagnose og prognose av NAFLD

Prosjektbeskrivelse:

I det moderne samfunnet, med fremveksten av industriell utvikling, har livsstilen blitt kraftig endret, noe som har ført til usunne vaner som overspising og inntak av fastfood (etter et ubalansert kosthold rikt på sukker og fett) og redusert fysisk aktivitet. I EU er over halvparten av voksne overvektige eller overvektige. Denne gruppen av individer anses å ha høy risiko for utvikling av kroniske leversykdommer som ikke-alkoholisk fettleversykdom (NAFLD). Mange epidemiologiske rapporter har knyttet utbruddet av NAFLD til dårlige kostholdsvalg og stillesittende vaner. Foreløpig er det ingen effektive farmakologiske terapier, og den eneste måten å forebygge eller forbedre tilstanden på er ved å lede en sunnere livsstil (personlig tilpassede dietter, fysisk aktivitet og kognitiv atferdspsykologisk terapi). Hovedbegrensningen for denne løsningen er mangelen på pasientens tilpasningsevne til terapien.

NAFLD omfatter et bredt histologisk spekter som spenner fra enkel steatose til ikke-alkoholisk steatohepatitt (NASH). NASH er preget av steatose med betennelse og kan presentere ulike stadier av fibrose, fra fraværende til cirrhose. Gullstandarden for diagnose og evaluering av fibrosestadiet forblir leverbiopsi. Det er imidlertid umulig å utføre en leverbiopsi for hver mistenkt NAFLD-pasient, både av etiske årsaker og fordi det ikke er en gyldig screeningsmetode. Derfor er det nødvendig å utvikle ikke-invasive metoder for screening og diagnose. Videre kan tidlig diagnose øke pasientens bevissthet om sin kroniske sykdom og motivere dem til å endre livsstil.

Med tanke på dette er det derfor nødvendig å utvikle ikke-invasive metoder for screening og diagnostisering. Videre kan tidlig diagnose øke pasientens bevissthet om sin kroniske tilstand og overbevise dem om å endre livsstil.

Det bør tas i betraktning at identifisering av nye markører kan være en svært utfordrende oppgave på grunn av:

Kompleksitet av fysiopatologi. Flere faktorer involvert i sykdomsprogresjon. Tilstedeværelse av vanlige mediatorer i mange andre fibrotiske lidelser. Derfor er en original strategi rettet mot å oppdage nye biomarkører av grunnleggende betydning. Takket være utviklingen av høykapasitetsteknologier, er i dag en enorm mengde genomiske og proteomiske data lett tilgjengelig i online databaser. Det er dermed mulig å studere interaktomet (protein-protein-interaksjoner -PPI- i en celle) ved å bruke åpen kildekode-programvare som Cytoscape. På denne måten lar bruken av bioinformatikk oss analysere i silico biologiske nettverksdata, som representerer en måte å identifisere biomarkører av klinisk interesse uten behov for dyrt utstyr.

Objektiv:

Målet med dette prosjektet er å identifisere (gjennom i silico-analyse) og validere nye biomarkører som er nyttige for diagnose og prognose av NAFLD, som kan brukes i ikke-invasive kliniske tester.

Vår første tilnærming til å identifisere kandidatbiomarkører var å bruke følgende arbeidskriterier i silico-studier:

1. Skaff PPI-data fra databaser som følger retningslinjene til International Molecular Exchange (IMEx)-konsortiet.
2. Konstruer biologiske nettverk for proteinene oppført i tabell 1 (som har blitt foreslått som kandidater for diagnosen NAFLD i nyere vitenskapelige tidsskrifter).
3. Konstruer biologiske nettverk for proteiner frigjort av hepatiske stellatceller (HSCs) som indikerer aktivering/reversjon av den myofibroblastiske fenotypen (HSCs er hovedcellene involvert i leverfibrose). Se tabell 1.
4. Inkluder i våre studier den kjente markøren for HSC-aktivering (α-glattmuskelaktin, α-SMA) og en essensiell komponent av den ekstracellulære matrisen (ECM): kollagen alfa-III type I (Col3A1).
5. Velg proteiner av interesse, dvs. de som frigjøres i serumet og som forbinder det største antallet biologiske nettverk.

Tabell 1 - Kandidatbiomarkører beskrevet i litteraturen Protein Relevant informasjon Lokalisering Cytokeratin-18 (CK-18) Indikator for hepatocellulær apoptose. Foreslått som en biomarkør i NAFLD Cytoplasm, nucleus Adipocyte fatty acid binding protein (AFABP) Rapportert som en biomarkør i NAFLD Cytoplasm Fibroblast vekstfaktor 21 (FGF21) Økt ekspresjon i lever og serum, korrelert med graden av steatose Frigitt insulin-lignende vekst faktorbindende protein 3 (IGFBP-3) Foreslått som en biomarkør for NAFLD i en nylig serumproteomstudie Utskilt lymfocytt cytosolisk protein 1 (LCP1) Aktinbindende protein, foreslått som en biomarkør i NAFLD Cytoplasma, membran Galectin-1 (LGALS1) Økt ekspresjon i aktiverte HSC-er Utskilt Ubiquitin-konjugasjonsfaktor E4B (UBE4B) Økt ekspresjon i aktiverte HSC-er Cytoplasma, utskilt Vitronectin (VTN) Økt ekspresjon i inaktiverte HSC-utskilte Osteopontin (OPN) Komponent av ECM-utskilt Laminin-utskilt ReducMB-uttrykk in1 . inaktiverte HSC-er utskilt α-SMA Økt ekspresjon i aktiverte HSC-er Cytoplasma Col3A1 Økt produksjon i fibrogenese (komponent av den ekstracellulære matrisen) utskilt

Basert på de beskrevne arbeidskriteriene og ved bruk av Cytoscape fikk vi et integrert biologisk nettverk (Figur 1), hvor hvert av PPI-nettverkene som ble opprettet for proteinene i Tabell 1 (12 biologiske nettverk) ble koblet sammen gjennom felles interaksjonsproteiner (felles partnere). Disse vanlige proteinene, spesielt de som frigjøres av celler (løselige faktorer), vil være våre målproteiner.

Fra vår foreløpige analyse har vi identifisert følgende proteiner som potensielle biomarkører: IGF-2 (insulinlignende vekstfaktor 2), SPARC (utskilt protein surt og rikt på cystein), EPICAN og EGFR (epidermal vekstfaktorreseptor) (uthevet i rødt i figur 1).

Eksperimentell plan

Forskningsaktivitetene vil bli utført ved Italian Liver Foundation. Prøveinnsamlingen vil finne sted ved den generelle kirurgiske avdelingen ved Cattinara sykehus.

For å nå de beskrevne målene vil grupper av pasientkandidater for fedmekirurgi ved Generell kirurgisk enhet bli involvert. Det er planlagt et legebesøk, hvor generell klinisk informasjon vil bli samlet inn, og målinger av vekt, høyde, midjeomkrets og blodtrykk vil bli tatt. Som en del av rutinemessige forberedelser før kirurgi og poliklinisk oppfølging, generelle hematologiske og biokjemiske parametere (fullstendig blodtelling, glukose, insulin, triglyserider, totalkolesterol, HDL, transferrin, ferritin, serumjern, C-reaktivt protein), lever funksjon (transaminaser, albumin, totalt protein) og nyrefunksjon (kreatinin, urinkreatinin, mikroalbuminuri) vil bli evaluert gjennom vanlige laboratorietester på plasma/serumprøver. En ekstra alikvot av de innsamlede prøvene vil bli brukt til RNA- og proteinekstraksjon og etterfølgende vurdering av prøvekvaliteten. Å gjennomgå en blodprøve, som rutinemessig utføres for diagnostiske undersøkelser og preoperativ vurdering, kan innebære øyeblikkelige smerter ved stikkstedet og utseendet til et blåmerke (hematom), komplikasjoner som kan oppstå ved enhver blodprøvetaking.

Videre, før operasjonen, vil leverelastometri bli utført, som vil tillate oss å sammenligne de radiologiske resultatene med laboratorieresultatene. Dette er en ikke-invasiv undersøkelse som ligner på en ultralyd. Disse undersøkelsene vil bli gjentatt etter ett år etter operasjonen for å kvantifisere de forventede forbedringene, mens bare blodprøven vil bli gjentatt etter seks måneder. Begge prosedyrene vil bli dekket av generell kirurgisk avdeling.

Under fedmekirurgien, som er planlagt for fedme i henhold til de nasjonale retningslinjene til SICOB, vil det bli utført subkutane, lever- og viscerale fettbiopsier. Disse biopsiene forlenger ikke operasjonstiden nevneverdig. I disse tre prøvene vil tilstedeværelsen og mengden av de studerte markørene bli verifisert. I tillegg vil en del av leverbiopsien bli sendt til patologiavdelingen for definitiv histologisk undersøkelse for å studere graden av fibrose og steatose. De innsamlede og bevarte prøvene for denne forskningen vil bli brukt til å overvåke pasientens helsetilstand. Videre kan resultatene av denne studien være nyttige for andre pasienter ved å bidra til forbedring av behandling og forebygging av alkoholfri fettleversykdom.

Pasienten som er planlagt for operasjonen vil bli gitt og forklart et informert samtykkeskjema før prosedyren, der de nevnte prosedyrene, risikoene og fordelene er beskrevet.

Forsøksplanen kan deles inn i tre faser:

Fase 1: Fordypning i silicostudier. Estimert tid: 1 måned.

Fase 2: In vivo studier, prøvetaking (blod og lever), prøvebank. Innsamling av kliniske og laboratoriedata for hver pasient.

Ekstraksjon av RNA og proteiner, etterfulgt av evaluering av prøvekvalitet. Kvantifisering av mRNA-uttrykk for panelet av biomarkører (tabell 1 + potensielle biomarkører).

Serum og vev (lever) kvantifisering av kandidatbiomarkører ved bruk av ELISA/Western blot.

Estimert tid: 9 måneder.

Fase 3: Validering av resultater:

De oppnådde resultatene vil bli korrelert med klinisk-analytiske data (blodverdier), leverbiopsidata (histopatologiske data) og tilgjengelige bildeteknikker (ultralyd, elastografi) ved Cattinara sykehus. Statistisk analyse vil bli utført for å korrelere de nye biomarkørene med sykdomsstadiet.

Estimert tid: 2 måneder.

Figur 1: I silicostudier.

Prøvestørrelse og statistisk analyse:

Det er planlagt innrullering av totalt 62 pasienter, både inneliggende og polikliniske pasienter, til studien. Den grunnleggende ligningen for å beregne prøvestørrelsen er som følger:

N = (2 x (Zα + Zβ)2 x S2) / d2

N = obligatoriske emner i hver prøvegruppe. Vi etablerte to grupper: Gruppe A (uten eller med mild fibrose, Brunt: 0-1) og Gruppe B (moderat til alvorlig fibrose, Brunt: 2-3).

Zα = Z-verdi for ønsket risiko (for oss er det 1,96 for en bilateral test). Zβ = Z-verdi for ønsket risiko (for oss er det 1,282 for en bilateral test). S2 = Varians eller spredning av den kvantitative parameteren for kontroll- eller referansegruppen (for oss, referansegruppe: Gruppe A, spredningsverdi = 150 U/L).

d = Minimumsverdien av den detekterbare forskjellen (for oss, 200 U/L).

Den beregnede prøvestørrelsen for hver gruppe ved bruk av denne prosedyren er 29,3. Å legge til en korreksjon for muligheten for prøvetap ved 5 % gir totalt 30,87. Totalt antall prøver er 62. Vi brukte denne analysen på en av markørene i studien (CK-18) fordi den er den mest rapporterte i litteraturen. Siden vår studie involverer studiet av 4 biomarkører, er det mulig at arbeid med et panel av markører vil øke sannsynligheten for studieresultater (potensielt redusere det nødvendige antallet prøver).

Nytte av studien:

Innenfor kroniske leversykdommer som NAFLD er det et presserende behov for identifisering og utvikling av ikke-invasive teknikker for diagnose og klinisk prognose. Disse metodene vil føre til raskere klinisk beslutningstaking, til fordel for både pasienter og medisinsk personell. Derfor har resultatene oppnådd fra denne studien som mål å bidra til identifisering og validering av nye serumbiomarkører for å forbedre diagnostisering, screening og behandling av NAFLD. Videre er det håp om at de validerte biomarkørene også kan brukes som prognostiske markører ved andre leversykdommer som utvikler seg med betennelse og fibrose. Tilgjengeligheten av ikke-invasive biomarkører vil ha en umiddelbar innvirkning i klinisk praksis, og skille mellom individer med høy fibroseprogresjonsrate og de som kan forbli i en ikke-proliferativ fase eller til og med oppnå remisjon. Denne informasjonen vil bidra til et mer nøyaktig valg og effektivitet av behandlingen, og dermed forbedre det totale pasientresultatet. I tillegg gir identifiseringen av spesifikke biomarkører, sammen med tilstedeværelsen av en biologisk prøvebank i vår institusjon, potensialet til å studere de molekylære prosessene som er involvert, ikke bare i denne tilstanden, men også i andre fibrogene prosesser i leveren, med mulighet for identifisere nye farmakologiske mål.

Gitt den observasjonsmessige karakteren til den foreslåtte studien, kreves det ingen tilleggsforsikringer utover de som allerede er gitt for normal klinisk praksis.