Biomarcadores en el diagnóstico y pronóstico de NAFLD

Descripción del Proyecto:

En la sociedad moderna, con la llegada del desarrollo industrial, el estilo de vida se ha modificado mucho, dando lugar a hábitos poco saludables como la sobrealimentación y el consumo de comida rápida (tras una dieta desequilibrada, rica en azúcares y grasas) y la reducción de la actividad física. En la Unión Europea, más de la mitad de los adultos tienen sobrepeso o son obesos. Este grupo de personas se considera de alto riesgo para el desarrollo de enfermedades hepáticas crónicas como la enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD). Muchos informes epidemiológicos han relacionado la aparición de NAFLD con malas elecciones dietéticas y hábitos sedentarios. Actualmente no existen terapias farmacológicas efectivas, y la única forma de prevenir o mejorar la afección es llevando un estilo de vida más saludable (dietas personalizadas, actividad física y terapias psicológicas cognitivo-conductuales). La principal limitación de esta solución es la falta de adaptabilidad del paciente a la terapia.

NAFLD abarca un amplio espectro histológico que va desde la esteatosis simple hasta la esteatohepatitis no alcohólica (NASH). NASH se caracteriza por esteatosis con inflamación y puede presentar diferentes estadios de fibrosis, desde ausente hasta cirrosis. El estándar de oro para el diagnóstico y la evaluación del estadio de fibrosis sigue siendo la biopsia hepática. Sin embargo, realizar una biopsia hepática a cada paciente sospechoso de EHGNA es imposible, tanto por razones éticas como porque no es un método de detección válido. Por tanto, es necesario desarrollar métodos no invasivos de detección y diagnóstico. Además, el diagnóstico precoz podría aumentar la conciencia de los pacientes sobre su enfermedad crónica y motivarlos a cambiar su estilo de vida.

Teniendo esto en cuenta, es necesario desarrollar métodos no invasivos de detección y diagnóstico. Además, un diagnóstico precoz podría aumentar la conciencia del paciente sobre su enfermedad crónica y convencerle de cambiar su estilo de vida.

Se debe considerar que identificar nuevos marcadores puede ser una tarea muy desafiante debido a:

Complejidad de la fisiopatología. Múltiples factores implicados en la progresión de la enfermedad. Presencia de mediadores comunes en muchos otros trastornos fibróticos. Por tanto, una estrategia original encaminada a descubrir nuevos biomarcadores es de fundamental importancia. Gracias al desarrollo de tecnologías de alto rendimiento, hoy en día se puede acceder fácilmente a una gran cantidad de datos genómicos y proteómicos en bases de datos en línea. De este modo, es posible estudiar el interactoma (interacciones proteína-proteína -PPI- dentro de una célula) utilizando software de código abierto como Cytoscape. De esta forma, el uso de la bioinformática nos permite analizar datos de redes biológicas in silico, lo que representa una forma de identificar biomarcadores de interés clínico sin necesidad de costosos equipos.

Objetivo:

El objetivo de este proyecto es identificar (mediante análisis in silico) y validar nuevos biomarcadores que sean útiles para el diagnóstico y pronóstico de NAFLD, que puedan usarse en pruebas clínicas no invasivas.

Nuestro enfoque inicial para identificar biomarcadores candidatos fue utilizar los siguientes criterios de trabajo en estudios in silico:

1. Obtenga datos de PPI de bases de datos que cumplan con los lineamientos del consorcio International Molecular Exchange (IMEx).
2. Construir redes biológicas para las proteínas enumeradas en la Tabla 1 (que se han propuesto como candidatas para el diagnóstico de NAFLD en revistas científicas recientes).
3. Construir redes biológicas para proteínas liberadas por células estrelladas hepáticas (HSC) que indican activación/reversión del fenotipo miofibroblástico (las HSC son las principales células implicadas en la fibrosis hepática). Ver Tabla 1.
4. Incluimos en nuestros estudios el conocido marcador de activación de HSC (α-actina del músculo liso, α-SMA) y un componente esencial de la matriz extracelular (MEC): el colágeno alfa-III tipo I (Col3A1).
5. Elegir proteínas de interés, es decir, aquellas que se liberan en el suero y que conectan el mayor número de redes biológicas.

Tabla 1 - Biomarcadores candidatos descritos en la literatura Proteína Información relevante Localización Citoqueratina-18 (CK-18) Indicador de apoptosis hepatocelular. Propuesto como biomarcador en NAFLD Citoplasma, núcleo Proteína de unión a ácidos grasos de adipocitos (AFABP) Reportado como biomarcador en NAFLD Citoplasma Factor de crecimiento de fibroblastos 21 (FGF21) Aumento de la expresión en el hígado y suero, correlacionado con el grado de esteatosis Crecimiento similar a la insulina liberada Proteína de unión al factor 3 (IGFBP-3) Propuesta como biomarcador de NAFLD en un estudio reciente sobre proteoma sérico. Proteína citosólica 1 de linfocitos secretados (LCP1) Proteína de unión a actina, sugerida como biomarcador en NAFLD Citoplasma, membrana Galectina-1 (LGALS1) Aumento de la expresión en HSC activadas Factor de conjugación de ubiquitina secretada E4B (UBE4B) Aumento de la expresión en HSC activadas Citoplasma, vitronectina secretada (VTN) Aumento de la expresión en HSC inactivadas Osteopontina secretada (OPN) Componente de la subunidad beta 1 de laminina secretada de la ECM (LAMB1) Expresión reducida en HSC inactivadas α-SMA secretada Aumento de la expresión en HSC activadas Citoplasma Col3A1 Aumento de la producción en fibrogénesis (componente de la matriz extracelular) Secretada

Con base en los criterios de trabajo descritos y usando Cytoscape, obtuvimos una red biológica integrada (Figura 1), donde cada una de las redes PPI creadas para las proteínas en la Tabla 1 (12 redes biológicas) se conectó a través de proteínas de interacción comunes (socios comunes). Estas proteínas comunes, especialmente las liberadas por las células (factores solubles), serán nuestras proteínas objetivo.

A partir de nuestro análisis preliminar, hemos identificado las siguientes proteínas como biomarcadores potenciales: IGF-2 (factor de crecimiento similar a la insulina 2), SPARC (proteína secretada ácida y rica en cisteína), EPICAN y EGFR (receptor del factor de crecimiento epidérmico) (destacadas en rojo en la Figura 1).

Plan experimental

Las actividades de investigación se llevarán a cabo en la Fundación Italiana del Hígado. La recogida de muestras se realizará en el Departamento de Cirugía General del Hospital Cattinara.

Para lograr los objetivos descritos se involucrarán grupos de pacientes candidatos a cirugía bariátrica en la Unidad de Cirugía General. Se programa una visita médica, durante la cual se recolectará información clínica general y se tomarán medidas de peso, talla, circunferencia de cintura y presión arterial. Como parte de los preparativos prequirúrgicos de rutina y del seguimiento ambulatorio, se requieren parámetros hematológicos y bioquímicos generales (hemograma completo, glucosa, insulina, triglicéridos, colesterol total, HDL, transferrina, ferritina, hierro sérico, proteína C reactiva), hígado. La función (transaminasas, albúmina, proteínas totales) y la función renal (creatinina, creatinina urinaria, microalbuminuria) se evaluarán mediante pruebas de laboratorio comunes en muestras de plasma/suero. Se utilizará una alícuota adicional de las muestras recolectadas para la extracción de ARN y proteínas y la posterior evaluación de la calidad de la muestra. La extracción de sangre, que se realiza de forma rutinaria para investigaciones diagnósticas y evaluación preoperatoria, puede implicar dolor momentáneo en el lugar de la punción y la aparición de un hematoma (hematoma), complicaciones que pueden ocurrir con cualquier extracción de sangre.

Además, antes de la cirugía se realizará una elastometría hepática, que nos permitirá comparar los resultados radiológicos con los de laboratorio. Este es un examen no invasivo similar a una ecografía. Estas investigaciones se repetirán al año de la cirugía para cuantificar las mejoras esperadas, mientras que solo la extracción de sangre se repetirá a los seis meses. Ambos procedimientos estarán cubiertos por el Departamento de Cirugía General.

Durante la cirugía bariátrica, que está programada para la obesidad según los lineamientos nacionales del SICOB, se realizarán biopsias de grasa subcutánea, hepática y visceral. Estas biopsias no prolongan significativamente los tiempos quirúrgicos. En estas tres muestras se comprobará la presencia y cantidad de los marcadores estudiados. Además, una parte de la biopsia hepática se enviará al departamento de patología para un examen histológico definitivo para estudiar el grado de fibrosis y esteatosis. Las muestras recolectadas y conservadas para esta investigación se utilizarán para controlar el estado de salud del paciente. Además, los resultados de este estudio podrían ser útiles para otros pacientes al contribuir a la mejora del tratamiento y la prevención de la enfermedad del hígado graso no alcohólico.

Al paciente programado para la cirugía se le entregará y explicará un formulario de consentimiento informado antes del procedimiento, donde se describen los procedimientos, riesgos y beneficios antes mencionados.

El plan experimental se puede dividir en tres fases:

Fase 1: Estudios in silico en profundidad. Tiempo estimado: 1 mes.

Fase 2: Estudios in vivo, recogida de muestras (sangre e hígado), banco de muestras. Recogida de datos clínicos y de laboratorio de cada paciente.

Extracción de ARN y proteínas, seguida de la evaluación de la calidad de la muestra. Cuantificación de la expresión de ARNm para el panel de biomarcadores (Tabla 1 + biomarcadores potenciales).

Cuantificación en suero y tejido (hígado) de biomarcadores candidatos mediante ELISA/Western blot.

Tiempo estimado: 9 meses.

Fase 3: Validación de resultados:

Los resultados obtenidos se correlacionarán con datos clínico-analíticos (valores sanguíneos), datos de biopsia hepática (datos histopatológicos) y técnicas de imagen disponibles (ultrasonido, elastografía) en el Hospital Cattinara. Se realizarán análisis estadísticos para correlacionar los nuevos biomarcadores con el estadio de la enfermedad.

Tiempo estimado: 2 meses.

Figura 1: Estudios in silico.

Tamaño de la muestra y análisis estadístico:

Para el estudio está prevista la inscripción de un total de 62 pacientes, tanto hospitalizados como ambulatorios. La ecuación fundamental para calcular el tamaño de la muestra es la siguiente:

N = (2 x (Zα + Zβ)2 x S2) / d2

N = sujetos requeridos en cada grupo de muestra. Establecimos dos grupos: Grupo A (sin o con fibrosis leve, Brunt: 0-1) y Grupo B (fibrosis moderada a grave, Brunt: 2-3).

Zα = valor Z para el riesgo deseado (para nosotros es 1,96 para una prueba bilateral). Zβ = valor Z para el riesgo deseado (para nosotros es 1,282 para una prueba bilateral). S2 = Varianza o dispersión del parámetro cuantitativo para el grupo control o de referencia (para nosotros, grupo de referencia: Grupo A, valor de dispersión = 150 U/L).

d = Valor mínimo de la diferencia detectable (para nosotros, 200 U/L).

El tamaño de muestra calculado para cada grupo utilizando este procedimiento es 29,3. Agregar una corrección por la posibilidad de pérdida de muestra al 5% produce un total de 30,87. El número total de muestras es 62. Aplicamos este análisis a uno de los marcadores del estudio (CK-18) porque es el más reportado en la literatura. Dado que nuestro estudio implica el estudio de 4 biomarcadores, es posible que trabajar con un panel de marcadores aumente la probabilidad de obtener resultados del estudio (reduciendo potencialmente la cantidad requerida de muestras).

Utilidad del estudio:

En el campo de las enfermedades hepáticas crónicas como la NAFLD, existe una necesidad urgente de identificación y desarrollo de técnicas no invasivas para el diagnóstico y pronóstico clínico. Estos métodos conducirán a una toma de decisiones clínicas más rápida, beneficiando tanto a los pacientes como al personal médico. Por tanto, los resultados obtenidos de este estudio pretenden contribuir a la identificación y validación de nuevos biomarcadores séricos para mejorar el diagnóstico, cribado y tratamiento de la NAFLD. Además, se espera que los biomarcadores validados también puedan utilizarse como marcadores de pronóstico en otras enfermedades hepáticas que progresan con inflamación y fibrosis. La disponibilidad de biomarcadores no invasivos tendría un impacto inmediato en la práctica clínica, distinguiendo entre individuos con una alta tasa de progresión de la fibrosis y aquellos que pueden permanecer en una fase no proliferativa o incluso alcanzar la remisión. Esta información contribuiría a una selección y eficacia más precisa de la terapia, mejorando así el resultado general del paciente. Además, la identificación de biomarcadores específicos, junto con la presencia de un banco de muestras biológicas en nuestra institución, brinda el potencial para estudiar a fondo los procesos moleculares involucrados no sólo en esta condición sino también en otros procesos fibrogénicos en el hígado, con la posibilidad de identificar nuevas dianas farmacológicas.

Dada la naturaleza observacional del estudio propuesto, no se requieren pólizas de seguro adicionales más allá de las ya proporcionadas para la práctica clínica habitual.