De acute effecten van inademing van e-sigaretten op de vaatfunctie, microcirculatie en trombose

Tweeëntwintig gezonde, vrouwelijke en mannelijke occasionele rokers of snusgebruikers (leeftijd 18-55, 10 sigaretten per maand, 10 zakjes snus per maand) worden opgenomen. Proefpersonen dienen minimaal 24 uur voorafgaand aan de blootstelling af te zien van inname van alcohol en cafeïne. Het gebruik van tabak (inclusief Zweedse vochtige snuiftabak) of het gebruik van e-sigaretten is niet toegestaan ​​binnen 7 dagen voorafgaand aan blootstelling.

Alle proefpersonen moeten een normale gezondheidsverklaring invullen.

Op een willekeurige cross-over manier inhaleren alle proefpersonen damp (30 trekjes gedurende 30 minuten) van één elektronische sigaret, eVic-Primo SE (Shenzhen Joyetech Co., Ltd., China). in een speciaal voorbereide ruimte met voldoende ventilatie.

Er zijn tal van fabrikanten en distributeurs van e-liquids op de markt. Onafhankelijke inhoudsanalyse toonde aan dat de nicotinevariatie tussen batches e-liquid laag is en dat de door de fabrikant opgegeven hoeveelheid nicotine vaak correct is. E-liquid zonder smaakstoffen (Valeo laboratories GmbH, Duitsland) zonder en met nicotine (19 mg/ml) wordt gebruikt. Inhoudsanalyse is gratis beschikbaar op de homepage van de fabrikant (http://www.e-liquid-wholesale.com). Een EC van de derde generatie wordt gebruikt met instellingen (Temperatuur 230°C, Effect 32 W, Weerstand 0,20 Ω).

Onderzoeksonderwerpen moeten gedurende ten minste 24 uur voorafgaand aan de blootstellingsreeksen afzien van inname van alcohol, evenals van cafeïne gedurende 12 uur. Tussen de twee gelegenheden zit minimaal een week. Onderwerpen rusten gedurende 15 minuten voorafgaand aan de blootstelling.

Na de eerste rust van 15 minuten worden de metingen voor verschillende cardiovasculaire eindpunten uitgevoerd bij aanvang en tot twee uur na beide blootstellingen. Dit zal gebeuren met de volgende methodes:

Meting van vasculaire functie

Fotopletysmografie (PPG) Arteriële stijfheid is een onafhankelijke maatstaf voor vasculaire schade en risico's, en kan het beste worden beoordeeld met de gouden standaardtechniek pulsgolfsnelheid (PWV). Deze methode is echter technisch veeleisend en vereist speciale apparatuur (zoals SphygmoCor) en geschoold studiepersoneel. Vingerfotoplethysmografie biedt echter mogelijk dezelfde informatie als PWV en is ideaal voor het continu meten van arteriële stijfheid.

pulsvoortplantingstijd (PPT), het interval van de systolische tot de diastolische piek van de pulsgolf. PPT is een opkomende marker voor arteriële stijfheid en vasculaire veroudering. Tegelijkertijd worden ECG- en warmtegeluiden door een microfoon opgenomen, waardoor de analyse gemakkelijker te valideren is.

Microcirculatie Iontoforese en laserspikkelcontrastbeeldvorming (LSCI) Microcirculatie wordt beoordeeld met een niet-invasieve methode waarbij twee stoffen (acetylcholine en nitroprusside) in een kleine kamer (0,5 ml) op het huidoppervlak worden aangebracht. Veranderingen in de microcirculatie worden gemeten met laser Doppler. De methode is volledig onschadelijk en pijnloos. Een ongebruikelijke maar plausibele bijwerking is lokale tijdelijke huiduitslag.

Voor elke hartslag wordt een drukgolf gegenereerd die zelfs de meest perifere delen van het lichaam bereikt. Door veranderingen in lichtabsorptie te meten, is het mogelijk om uitzettingen (zelfs zeer kleine) in de perifere slagaders en arteriolen in het onderhuidse weefsel, bijvoorbeeld in de vingertop, te beoordelen. De microcirculatie kan ook worden gemeten met laserspikkelcontrastbeeldvorming (LSCI), een niet-invasieve, volledig pijnvrije methode om de microcirculatie van de huid te beoordelen.

Bloeddruk Een semi-automatische oscillometrische bloeddrukmeter wordt gebruikt om de bloeddruk en hartslag te meten.

Bloedafname Bloedmonsters worden afgenomen in reageerbuizen die 1/10 0,129 M natriumcitraat, EDTA en serum bevatten bij aanvang, 0 uur, 1 uur en 2 uur na blootstelling. Plasma wordt later verzameld na centrifugatie bij 2000 g gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur (KT) en vervolgens ingevroren bij -70°C tot analyse.

Meting van trombusvorming (T-TAS) T-TAS® (Total Thrombus-formation Analysis System) is een manier om trombusvorming te beoordelen tijdens variabele stromingsomstandigheden met behulp van een klein bloedmonster.

Meting van cotinine Niveaus van cotinine zullen in serum worden gemeten met behulp van een in de handel verkrijgbare ELISA-techniek.

Door middel van directe microscopie van de haarvaten van het nagelbed van een van de vingers kan de capillaire doorbloeding worden bepaald (capillaire bloedcelsnelheid, CBV, mm/s). Dit is een volledig pijnloze en niet-invasieve methode die ongeveer 15 minuten duurt om uit te voeren.

Meting van MV Plasma wordt ontdooid en gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur gecentrifugeerd bij 2000 g. Het supernatant wordt vervolgens opnieuw gecentrifugeerd bij 13.000 g gedurende 2 minuten bij RT. 20 μl monster wordt gedurende 20 minuten in het donker geïncubeerd met phalloidin-Alexa-660 (Invitrogen, Paisley, VK), lactadherine-FITC (Heematologic Technologies, Vermont, VS), CD42a-PE (Platelet-MP (PMP), BD, Clone Alma-16), CD45-PC7 (Leukocyte-MV (LMV), Beckman Coulter, Dublin, Ierland) en CD144-APC (Endothelial-MV (EMV), AH diagnostics, Stockholm, SWE). PMV's zijn ook gelabeld met CD154-PE (CD40L, abcam, Cambridge, VK) en EMV's met CD62E (E-selectin, Beckman Coulter, Dublin, Ierland). MV's worden gemeten met flowcytometrie op een Beckman Gallios-instrument (CA, VS). De MV-gate wordt bepaald met behulp van Megamix-korrels (BioCytex, Marseille, Frankrijk), een mix van korrels met een diameter van respectievelijk 0,5 μm, 0,9 μm en 3,0 μm. MV's worden gedefinieerd als deeltjes kleiner dan 1,0 μm groot, negatief voor phalloidin (om celmembraanfragmenten uit te sluiten) en positief voor lactadherine. Geconjugeerd isotype-gematcht immunoglobuline (IgG1-FITC, IgG1-PE, IgG1-APC en IgG1-PC7) zonder reactiviteit tegen humane antigenen wordt gebruikt als een negatieve controle om de achtergrondruis van de cytometrische analyse te definiëren. Het absolute aantal MV's wordt berekend met behulp van de volgende formule: (MV geteld x standaardparels ⁄ L) ⁄ standaardparels geteld, (FlowCount, Beckman Coulter).

Om te bepalen of MV's worden vrijgegeven als gevolg van activering of apoptose, worden MV's gelabeld met SYTO 13. SYTO 13 (Molecular Probes) is celdoorlatend en heeft een hoge fluorescentieopbrengst wanneer gebonden aan DNA of RNA. Onze hypothese is dat MV's die vrijkomen uit apoptotische cellen meer DNA of RNA tot expressie brengen.

Pro-coagulerend effect van MV's In vitro experimenten worden uitgevoerd om de invloed van MV's op de vorming van trombine en de relatieve bijdrage van het negatief geladen oppervlak van MV's te onderzoeken. In het kort worden plasmamonsters ontdooid en na de hierboven beschreven centrifugatiestappen centrifugeren we de monsters verder (tweemaal 21.000 g in 45 min, KT) om een ​​MV-verrijkte pellet te verkrijgen. De pellet wordt vervolgens toegevoegd aan commercieel plasma (Haemochrom, Diagnostica, Essen, Duitsland) zonder toevoeging van TF of fosfolipiden. De vorming van trombine in plasma wordt bepaald door gebruik te maken van het gekalibreerde geautomatiseerde trombogram (CAT) zoals oorspronkelijk beschreven door Hemker et al. Het berekende gebied onder de curve vertegenwoordigt de totale hoeveelheid trombine die in de loop van de tijd wordt gegenereerd en wordt het endogene trombinepotentieel (ETP) genoemd. Tijd tot het begin van trombinevorming (vertragingstijd), maximale concentratie van trombinevorming (piek trombine) en tijd tot maximale trombinevorming (tijd tot piek trombine) wordt ook beoordeeld in CAT-analyse.