Akutní účinky inhalace e-cigarety na vaskulární funkci, mikrocirkulaci a trombózu

Zahrnuto bude 22 zdravých, příležitostných kuřáků a mužů snusu nebo uživatelů snusu (věk 18-55 let, 10 cigaret měsíčně, 10 sáčků snusu měsíčně). Od výzkumných subjektů se vyžaduje, aby se alespoň 24 hodin před expozicí zdržely příjmu alkoholu a kofeinu. Užívání tabáku (včetně švédského vlhkého šňupacího tabáku) nebo používání elektronických cigaret není povoleno během 7 dnů před expozicí.

Všechny subjekty musí vyplnit normální zdravotní prohlášení.

V náhodném zkříženém způsobu budou všechny subjekty vdechovat páru (30 potahů po dobu 30 minut) z jedné elektronické cigarety, eVic-Primo SE (Shenzhen Joyetech Co., Ltd., Čína). ve speciálně připravené místnosti s dostatečným větráním.

Na trhu je spousta výrobců a distributorů e-liquidů. Nezávislá analýza obsahu ukázala, že kolísání nikotinu mezi šaržemi e-liquidu je nízké a že množství nikotinu, jak uvádí výrobce, je často správné. Bude použit E-liquid bez jakýchkoli dochucovadel (Valeo laboratories GmbH, Německo) bez a s nikotinem (19 mg/ml). Analýza obsahu je zdarma k dispozici na domovské stránce výrobce (http://www.e-liquid-wholesale.com). Je použit EC třetí generace s nastavením (teplota 230°C, účinek 32 W, odpor 0,20 Ω).

Od výzkumných subjektů se vyžaduje, aby se alespoň 24 hodin před expozičními sekvencemi zdržely pití alkoholu, stejně jako kofeinu po dobu 12 hodin. Tyto dvě události budou od sebe dělit minimálně jeden týden. Subjekty před expozicí odpočívají 15 minut.

Po úvodní 15minutové přestávce se provedou měření pro různé kardiovaskulární koncové body na začátku a do dvou hodin po obou expozicích. To bude provedeno následujícími metodami:

Měření funkce cév

Fotopletysmografie (PPG) Arteriální ztuhlost je nezávislým měřítkem vaskulárního poškození a rizika a nejlépe se hodnotí pomocí techniky zlatého standardu pulse-wave velocity (PWV). Tato metoda je však technicky náročná a vyžaduje speciální vybavení (jako SphygmoCor) a vzdělaný studijní personál. Fotopletysmografie prstů však potenciálně poskytuje stejné informace jako PWV a je ideální pro kontinuální měření tuhosti tepen.

doba šíření pulzu (PPT), interval od systolického k diastolickému vrcholu pulzní vlny. PPT je nadcházející marker arteriální tuhosti a vaskulárního stárnutí. Současně budou zaznamenávány EKG a zvuky tepla z mikrofonu, což usnadní ověření analýzy.

Mikrocirkulace Iontoforéza a laserové tečkované kontrastní zobrazení (LSCI) Mikrocirkulace je hodnocena neinvazivní metodou, kdy se dvě látky (acetylcholin a nitroprusid) aplikují v malé komůrce (0,5 ml) na povrch kůže. Změny mikrocirkulace se měří laserovým dopplerem. Metoda je zcela neškodná a bezbolestná. Méně častým, ale pravděpodobným vedlejším účinkem je lokální dočasná kožní vyrážka.

Při každém úderu srdce se generuje tlaková vlna, která zasahuje i do nejokrajovějších částí těla. Měřením změn absorpce světla je možné hodnotit distenze (i velmi malé) v periferních tepnách a arteriolách v podkoží, například na špičce prstu. Mikrocirkulaci lze také měřit laserovým tečkovaným kontrastním zobrazením (LSCI), což je neinvazivní zcela bezbolestná metoda pro hodnocení mikrocirkulace kůže.

Krevní tlak Pro měření krevního tlaku a srdeční frekvence bude použit poloautomatický oscilometrický tlakoměr.

Odběr krve Vzorky krve se odeberou do zkumavek obsahujících 1/10 0,129 M citrátu sodného, ​​EDTA a sérum na začátku, v 0 hodině, 1 hodině a 2 hodinách po expozici. Plazma se později odebere po centrifugaci při 2 000 g po dobu 20 minut při teplotě místnosti (RT) a poté se zmrazí při -70 °C až do analýzy.

Měření tvorby trombu (T-TAS) T-TAS® (Total Thrombus-formation Analysis System) je prostředek pro hodnocení tvorby trombu za podmínek proměnlivého průtoku pomocí malého vzorku krve.

Měření kotininu Hladiny kotininu budou měřeny v séru pomocí komerčně dostupné techniky ELISA.

Přímou mikroskopií kapilár nehtového lůžka jednoho z prstů lze hodnotit kapilární průtok krve (rychlost kapilárních krvinek, CBV, mm/s). Jedná se o zcela bezbolestnou a neinvazivní metodu, která trvá asi 15 minut.

Měření MV plazmy se rozmrazí a centrifuguje při 2000 g po dobu 20 minut při teplotě místnosti. Supernatant se poté znovu odstředí při 13 000 g po dobu 2 minut při teplotě místnosti. 20 μl vzorku se inkubuje 20 minut ve tmě s phalloidin-Alexa-660 (Invitrogen, Paisley, UK), laktadherin-FITC (Haematologic Technologies, Vermont, USA), CD42a-PE (Platelet-MP (PMP), BD, Klon Alma-16), CD45-PC7 (Leukocyte-MV (LMV), Beckman Coulter, Dublin, Irsko) a CD144-APC (Endoteliální-MV (EMV), diagnostika AH, Stockholm, SWE). PMV jsou také označeny CD154-PE (CD40L, abcam, Cambridge, Spojené království) a EMV CD62E (E-selectin, Beckman Coulter, Dublin, Irsko). MV se měří průtokovou cytometrií na přístroji Beckman Gallios (CA, USA). MV-brána je určena pomocí kuliček Megamix (BioCytex, Marseille, Francie), což je směs kuliček o průměrech 0,5 μm, 0,9 μm a 3,0 μm. MV jsou definovány jako částice o velikosti menší než 1,0 μm, negativní na faloidin (aby se vyloučily fragmenty buněčné membrány) a pozitivní na laktadherin. Konjugát izotypově shodný imunoglobulin (IgG1-FITC, IgG1-PE, IgG1-APC a IgG1-PC7) bez reaktivity proti lidským antigenům se používá jako negativní kontrola k definování šumu pozadí cytometrické analýzy. Absolutní počet MVs se vypočítá pomocí následujícího vzorce: (MV spočítané x standardní kuličky ⁄ L) ⁄ spočítané standardní kuličky, (FlowCount, Beckman Coulter).

Pro určení, zda se MV uvolňují v důsledku aktivace nebo apoptózy, jsou MV označeny SYTO 13. SYTO 13 (Molecular Probes) je propustný pro buňky a má vysoký fluorescenční výtěžek, když je navázán na DNA nebo RNA. Naše hypotéza je, že MV uvolněné z apoptotických buněk exprimují více DNA nebo RNA.

Prokoagulační účinek MV Experimenty in vitro se provádějí za účelem zkoumání vlivu MV na tvorbu trombinu a relativní příspěvek negativně nabitého povrchu poskytovaného MV. Krátce se vzorky plazmy rozmrazí a po krocích centrifugace popsaných výše vzorky dále centrifugujeme (dvakrát 21 000 g za 45 minut, RT), abychom získali peletu obohacenou o MV. Peleta se poté přidá do komerční plazmy (Haemochrom, Diagnostica, Essen, Německo) bez přidání TF nebo fosfolipidů. Generování trombinu v plazmě se určuje pomocí kalibrovaného automatického trombogramu (CAT), jak původně popsal Hemker et al. Vypočtená plocha pod křivkou představuje celkové množství trombinu generovaného v průběhu času a nazývá se endogenní trombinový potenciál (ETP). Čas do začátku tvorby trombinu (doba zpoždění), maximální koncentrace tvorby trombinu (vrchol trombinu) a doba do maximální tvorby trombinu (doba do maxima trombinu) se také hodnotí v CAT analýze.