Los efectos agudos de la inhalación de cigarrillos electrónicos sobre la función vascular, la microcirculación y la trombosis

Se incluirán veintidós fumadores ocasionales o usuarios de snus sanos, mujeres y hombres (edad 18-55, 10 cigarrillos por mes, 10 bolsas de snus por mes). Los sujetos de investigación deben abstenerse de ingerir alcohol y cafeína durante al menos 24 horas antes de la exposición. No se permite el uso de tabaco (incluido el rapé húmedo sueco) o el uso de cigarrillos electrónicos dentro de los 7 días anteriores a la exposición.

Todos los sujetos tienen que completar una declaración de salud normal.

De forma cruzada aleatoria, todos los sujetos inhalarán vapor (30 bocanadas durante 30 minutos) de un cigarrillo electrónico, eVic-Primo SE (Shenzhen Joyetech Co., Ltd., China). en una habitación especialmente preparada con ventilación adecuada.

Hay muchos fabricantes y distribuidores de e-líquido en el mercado. El análisis de contenido independiente mostró que la variación de nicotina entre los lotes de e-líquido es baja y que la cantidad de nicotina indicada por el fabricante a menudo es correcta. Se utilizará E-líquido sin saborizantes (Valeo laboratorios GmbH, Alemania) sin y con nicotina (19 mg/ml). El análisis de contenido está disponible de forma gratuita en la página de inicio del fabricante (http://www.e-liquid-wholesale.com). Se utiliza un EC de tercera generación con ajustes (Temperatura 230°C, Efecto 32 W, Resistencia 0,20 Ω).

Los sujetos de investigación deben abstenerse de ingerir alcohol durante al menos 24 horas antes de las secuencias de exposición, así como cafeína durante 12 horas. Las dos ocasiones estarán separadas por al menos una semana. Los sujetos descansan durante 15 minutos antes de la exposición.

Después del descanso inicial de 15 minutos, las mediciones para varios criterios de valoración cardiovasculares se realizarán al inicio del estudio y hasta dos horas después de ambas exposiciones. Esto se hará con los siguientes métodos:

Medición de la función vascular

Fotopletismografía (PPG) La rigidez arterial es una medida independiente del daño y el riesgo vascular, y se evalúa mejor con la técnica estándar de oro de velocidad de onda de pulso (PWV). Sin embargo, este método es técnicamente exigente y requiere equipo especial (como SphygmoCor) y personal de estudio capacitado. Sin embargo, la fotopletismografía digital proporciona potencialmente la misma información que la PWV y es ideal para la medición continua de la rigidez arterial.

tiempo de propagación del pulso (PPT), el intervalo desde el pico sistólico hasta el diastólico de la onda del pulso. PPT es un marcador próximo para la rigidez arterial y el envejecimiento vascular. Al mismo tiempo, se grabarán el ECG y los sonidos de calor por un micrófono, lo que facilitará la validación del análisis.

Iontoforesis de microcirculación e imágenes de contraste moteado con láser (LSCI) La microcirculación se evalúa mediante un método no invasivo en el que se aplican dos sustancias (acetilcolina y nitroprusiato) en una pequeña cámara (0,5 ml) sobre la superficie de la piel. Los cambios en la microcirculación se miden con láser Doppler. El método es completamente inofensivo y sin dolor. Un efecto secundario poco común pero plausible es la erupción cutánea temporal local.

Por cada latido del corazón se genera una onda de presión que llega incluso a las partes más periféricas del cuerpo. Al medir los cambios en la absorción de luz, es posible evaluar distensiones (incluso muy pequeñas) en las arterias periféricas y arteriolas en el tejido subcutáneo, por ejemplo, en la punta del dedo. La microcirculación también se puede medir mediante imágenes de contraste moteado con láser (LSCI), que es un método no invasivo y completamente indoloro para evaluar la microcirculación de la piel.

Presión arterial Se utilizará un esfigmomanómetro oscilométrico semiautomático para medir la presión arterial y la frecuencia cardíaca.

Muestreo de sangre Las muestras de sangre se extraerán en tubos de ensayo que contengan 1/10 de citrato de sodio 0,129 M, EDTA y suero al inicio, a las 0 horas, 1 hora y 2 horas después de la exposición. Posteriormente, el plasma se recolecta después de la centrifugación a 2 000 g durante 20 min a temperatura ambiente (RT) y luego se congela a -70 °C hasta el análisis.

Medición de la formación de trombos (T-TAS) T-TAS® (Sistema de análisis de formación de trombos totales) es un medio para evaluar la formación de trombos durante condiciones de flujo variable utilizando una pequeña muestra de sangre.

Medición de cotinina Los niveles de cotinina se medirán en suero usando una técnica ELISA comercialmente disponible.

Mediante microscopía directa de los capilares del lecho ungueal de uno de los dedos se puede evaluar el flujo sanguíneo capilar (velocidad de células sanguíneas capilares, CBV, mm/s). Este es un método completamente indoloro y no invasivo que tarda unos 15 minutos en realizarse.

Medición de MV El plasma se descongela y se centrifuga a 2000 g durante 20 minutos a temperatura ambiente. A continuación, el sobrenadante se vuelve a centrifugar a 13 000 g durante 2 minutos a temperatura ambiente. Se incuban 20 μl de muestra durante 20 minutos en la oscuridad con faloidina-Alexa-660 (Invitrogen, Paisley, Reino Unido), lactadherina-FITC (Haematologic Technologies, Vermont, EE. UU.), CD42a-PE (Platelet-MP (PMP), BD, Clon Alma-16), CD45-PC7 (Leukocyte-MV (LMV), Beckman Coulter, Dublin, Irlanda) y CD144-APC (Endothelial-MV (EMV), AH diagnostics, Estocolmo, SWE). Los PMV también están etiquetados con CD154-PE (CD40L, abcam, Cambridge, Reino Unido) y los EMV con CD62E (E-selectina, Beckman Coulter, Dublín, Irlanda). Los MV se miden mediante citometría de flujo en un instrumento Beckman Gallios (CA, EE. UU.). La puerta MV se determina utilizando perlas Megamix (BioCytex, Marsella, Francia), que es una mezcla de perlas con diámetros de 0,5 μm, 0,9 μm y 3,0 μm, respectivamente. Las MV se definen como partículas de menos de 1,0 μm de tamaño, negativas a faloidina (para excluir fragmentos de membrana celular) y positivas a lactadherina. La inmunoglobulina conjugada de isotipo coincidente (IgG1-FITC, IgG1-PE, IgG1-APC e IgG1-PC7) sin reactividad frente a antígenos humanos se utiliza como control negativo para definir el ruido de fondo del análisis citométrico. El número absoluto de MV se calcula mediante la siguiente fórmula: (MV contadas x perlas estándar ⁄ L) ⁄ perlas estándar contadas, (FlowCount, Beckman Coulter).

Para determinar si los MV se liberan debido a la activación o apoptosis, los MV se etiquetan con SYTO 13. SYTO 13 (Molecular Probes) es permeable a las células y tiene un alto rendimiento fluorescente cuando se une a ADN o ARN. Nuestra hipótesis es que los MV liberados de las células apoptóticas expresan más ADN o ARN.

Efecto procoagulante de las MV Se realizan experimentos in vitro para investigar la influencia de las MV en la generación de trombina y la contribución relativa de la superficie cargada negativamente proporcionada por las MV. Brevemente, las muestras de plasma se descongelan y, después de los pasos de centrifugación descritos anteriormente, centrifugamos más las muestras (dos veces 21 000 g en 45 min, TA) para obtener un sedimento enriquecido con MV. Luego, el sedimento se agrega al plasma comercial (Haemochrom, Diagnostica, Essen, Alemania) sin adición de TF o fosfolípidos. La generación de trombina en plasma se determina usando el trombograma automatizado calibrado (CAT) como se describió originalmente por Hemker et al. El área calculada bajo la curva representa la cantidad total de trombina generada a lo largo del tiempo y se denomina potencial de trombina endógena (ETP). El tiempo hasta el inicio de la generación de trombina (tiempo de retraso), la concentración máxima de generación de trombina (trombina máxima) y el tiempo hasta la generación máxima de trombina (tiempo hasta la trombina máxima) también se evalúan en el análisis CAT.