Die akuten Auswirkungen der E-Zigaretten-Inhalation auf Gefäßfunktion, Mikrozirkulation und Thrombose

Zweiundzwanzig gesunde weibliche und männliche Gelegenheitsraucher oder Snuskonsumenten (Alter 18-55, 10 Zigaretten pro Monat, 10 Beutel Snus pro Monat) werden eingeschlossen. Die Versuchspersonen müssen mindestens 24 Stunden vor der Exposition auf den Konsum von Alkohol und Koffein verzichten. Der Konsum von Tabak (einschließlich schwedischem feuchtem Schnupftabak) oder der Konsum von E-Zigaretten ist innerhalb von 7 Tagen vor der Exposition nicht gestattet.

Alle Probanden müssen eine normale Gesundheitserklärung ausfüllen.

In einem randomisierten Cross-Over-Modus inhalieren alle Probanden Dampf (30 Züge für 30 Minuten) von einer elektronischen Zigarette, eVic-Primo SE (Shenzhen Joyetech Co., Ltd., China). in einem speziell vorbereiteten Raum mit ausreichender Belüftung.

Es gibt viele Hersteller und Händler von E-Liquids auf dem Markt. Unabhängige Inhaltsanalysen haben gezeigt, dass die Schwankungen des Nikotingehalts zwischen den E-Liquid-Chargen gering sind und dass die vom Hersteller angegebene Nikotinmenge oft korrekt ist. Es wird E-Liquid ohne Aromastoffe (Valeo Labors GmbH, Deutschland) ohne und mit Nikotin (19 mg/ml) verwendet. Die Inhaltsanalyse ist auf der Homepage des Herstellers (http://www.e-liquid-wholesale.com) kostenlos verfügbar. Verwendet wird ein EC der dritten Generation mit Einstellungen (Temperatur 230°C, Leistung 32 W, Widerstand 0,20 Ω).

Die Versuchspersonen müssen mindestens 24 Stunden vor den Expositionssequenzen auf Alkohol sowie 12 Stunden auf Koffein verzichten. Die beiden Anlässe liegen mindestens eine Woche auseinander. Die Probanden ruhen sich 15 Minuten vor der Exposition aus.

Nach der ersten 15-minütigen Ruhepause werden die Messungen für verschiedene kardiovaskuläre Endpunkte zu Studienbeginn und bis zu zwei Stunden nach beiden Expositionen durchgeführt. Dies geschieht mit den folgenden Methoden:

Messung der Gefäßfunktion

Photopletysmographie (PPG) Die Arteriensteifigkeit ist ein unabhängiges Maß für Gefäßschäden und -risiken und wird am besten mit der Goldstandard-Technik Pulswellengeschwindigkeit (PWV) beurteilt. Diese Methode ist jedoch technisch anspruchsvoll und erfordert eine spezielle Ausrüstung (wie SphygmoCor) und ausgebildetes Studienpersonal. Die Finger-Photoplethysmographie liefert jedoch möglicherweise die gleichen Informationen wie PWV und ist ideal für die kontinuierliche Messung der arteriellen Steifigkeit.

Pulslaufzeit (PPT), das Intervall von der systolischen bis zur diastolischen Spitze der Pulswelle. PPT ist ein zukünftiger Marker für Arteriensteifigkeit und Gefäßalterung. Gleichzeitig werden EKG- und Hitzegeräusche von einem Mikrofon aufgezeichnet, wodurch die Analyse einfacher zu validieren ist.

Mikrozirkulation Iontophorese und Laser-Speckle-Kontrast-Bildgebung (LSCI) Die Mikrozirkulation wird durch eine nicht-invasive Methode beurteilt, bei der zwei Substanzen (Acetylcholin und Nitroprussid) in einer kleinen Kammer (0,5 ml) auf die Hautoberfläche aufgetragen werden. Veränderungen in der Mikrozirkulation werden mit Laser-Doppler gemessen. Die Methode ist völlig ungefährlich und schmerzfrei. Eine gelegentliche, aber plausible Nebenwirkung ist ein lokaler vorübergehender Hautausschlag.

Bei jedem Herzschlag wird eine Druckwelle erzeugt, die selbst die periphersten Stellen des Körpers erreicht. Durch die Messung von Änderungen in der Lichtabsorption ist es möglich, Dehnungen (selbst sehr kleine) in den peripheren Arterien und Arteriolen im subkutanen Gewebe, beispielsweise in der Fingerspitze, zu beurteilen. Die Mikrozirkulation kann auch durch Laser-Speckle-Kontrast-Bildgebung (LSCI) gemessen werden, die eine nicht-invasive, völlig schmerzfreie Methode zur Beurteilung der Mikrozirkulation der Haut ist.

Blutdruck Zur Messung des Blutdrucks und der Herzfrequenz wird ein halbautomatisches oszillometrisches Blutdruckmessgerät verwendet.

Blutentnahme Blutproben werden in Teströhrchen gezogen, die 1/10 0,129 M Natriumcitrat, EDTA und Serum zu Beginn, 0 Stunden, 1 Stunde und 2 Stunden nach der Exposition enthalten. Das Plasma wird später nach 20-minütiger Zentrifugation bei 2000 g bei Raumtemperatur (RT) gesammelt und dann bis zur Analyse bei -70 °C eingefroren.

Messung der Thrombusbildung (T-TAS) T-TAS® (Total Thrombus-formation Analysis System) ist ein Mittel zur Beurteilung der Thrombusbildung bei variablen Strömungsbedingungen anhand einer kleinen Blutprobe.

Messung von Cotinin Die Cotininspiegel werden im Serum unter Verwendung einer im Handel erhältlichen ELISA-Technik gemessen.

Durch direkte Mikroskopie der Kapillaren des Nagelbetts eines der Finger kann der kapillare Blutfluss beurteilt werden (Kapillarblutzellengeschwindigkeit, CBV, mm/s). Dies ist eine völlig schmerzfreie und nicht-invasive Methode, die etwa 15 Minuten dauert.

Messung von MV Plasma wird aufgetaut und bei 2000 g für 20 Minuten bei RT zentrifugiert. Der Überstand wird dann erneut zentrifugiert, bei 13.000 g für 2 Minuten bei RT. 20 μl der Probe werden für 20 Minuten im Dunkeln mit Phalloidin-Alexa-660 (Invitrogen, Paisley, UK), Lactadherin-FITC (Haematologic Technologies, Vermont, USA), CD42a-PE (Platelet-MP (PMP), BD, Klon Alma-16), CD45-PC7 (Leukozyten-MV (LMV), Beckman Coulter, Dublin, Irland) und CD144-APC (Endothelial-MV (EMV), AH Diagnostics, Stockholm, SWE). PMVs sind auch mit CD154-PE (CD40L, abcam, Cambridge, UK) und EMVs mit CD62E (E-Selectin, Beckman Coulter, Dublin, Irland) gekennzeichnet. MVs werden durch Durchflusszytometrie auf einem Beckman-Gallios-Instrument (CA, USA) gemessen. Das MV-Gate wird unter Verwendung von Megamix-Beads (BioCytex, Marseille, Frankreich) bestimmt, bei denen es sich um eine Mischung aus Beads mit Durchmessern von 0,5 &mgr;m, 0,9 &mgr;m bzw. 3,0 &mgr;m handelt. MVs sind definiert als Partikel mit einer Größe von weniger als 1,0 μm, negativ für Phalloidin (um Zellmembranfragmente auszuschließen) und positiv für Lactadherin. Isotyp-konjugiertes Immunglobulin (IgG1-FITC, IgG1-PE, IgG1-APC und IgG1-PC7) ohne Reaktivität gegenüber humanen Antigenen wird als Negativkontrolle verwendet, um das Hintergrundrauschen der zytometrischen Analyse zu definieren. Die absolute Anzahl von MVs wird mittels der folgenden Formel berechnet: (gezählte MV x Standardkügelchen ⁄ L) ⁄ gezählte Standardkügelchen, (FlowCount, Beckman Coulter).

Um zu bestimmen, ob MVs aufgrund von Aktivierung oder Apoptose freigesetzt werden, werden MVs mit SYTO 13 markiert. SYTO 13 (Molecular Probes) ist zelldurchlässig und hat eine hohe Fluoreszenzausbeute, wenn es an DNA oder RNA gebunden ist. Unsere Hypothese ist, dass aus apoptotischen Zellen freigesetzte MVs mehr DNA oder RNA exprimieren.

Gerinnungsfördernde Wirkung von MVs In-vitro-Experimente werden durchgeführt, um den Einfluss von MVs auf die Thrombinerzeugung und den relativen Beitrag der negativ geladenen Oberfläche, die von MVs bereitgestellt wird, zu untersuchen. Plasmaproben werden kurz aufgetaut und nach den oben beschriebenen Zentrifugationsschritten zentrifugieren wir die Proben weiter (zweimal 21.000 g in 45 min, RT), um ein MV-angereichertes Pellet zu erhalten. Das Pellet wird dann zu handelsüblichem Plasma (Haemochrom, Diagnostica, Essen, Deutschland) ohne Zugabe von TF oder Phospholipiden gegeben. Die Thrombinbildung im Plasma wird unter Verwendung des kalibrierten automatisierten Thrombogramms (CAT) bestimmt, wie es ursprünglich von Hemker et al. beschrieben wurde. Die berechnete Fläche unter der Kurve stellt die über die Zeit erzeugte Gesamtmenge an Thrombin dar und wird als endogenes Thrombinpotential (ETP) bezeichnet. Die Zeit bis zum Beginn der Thrombinerzeugung (Verzögerungszeit), die maximale Konzentration der Thrombinerzeugung (Peak-Thrombin) und die Zeit bis zur maximalen Thrombinerzeugung (Zeit bis zum Peak-Thrombin) wird ebenfalls in der CAT-Analyse bewertet.