Острые эффекты вдыхания электронных сигарет на сосудистую функцию, микроциркуляцию и тромбоз

В исследование будут включены двадцать две здоровые женщины и мужчины, периодически курящие или употребляющие снюс (возраст 18–55 лет, 10 сигарет в месяц, 10 пакетов снюса в месяц). Испытуемые должны воздерживаться от приема алкоголя и кофеина в течение как минимум 24 часов до воздействия. Употребление табака (в том числе шведского влажного нюхательного табака) или электронных сигарет запрещено в течение 7 дней до заражения.

Все субъекты должны заполнить обычную декларацию о состоянии здоровья.

В случайном перекрестном режиме все испытуемые будут вдыхать пар (30 затяжек в течение 30 минут) от одной электронной сигареты eVic-Primo SE (Shenzhen Joyetech Co., Ltd., Китай). в специально подготовленном помещении с достаточной вентиляцией.

На рынке существует множество производителей и дистрибьюторов жидкостей для электронных сигарет. Независимый анализ содержания показал, что различия в содержании никотина в партиях жидкостей для электронных сигарет невелики и что количество никотина, заявленное производителем, часто является правильным. Будет использоваться жидкость для электронных сигарет без каких-либо ароматизаторов (Valeo Laboratories GmbH, Германия) без и с содержанием никотина (19 мг/мл). Контент-анализ доступен бесплатно на домашней странице производителя (http://www.e-liquid-wholesale.com). Используется ЭК третьего поколения с настройками (температура 230°C, мощность 32 Вт, сопротивление 0,20 Ом).

Испытуемые должны воздерживаться от приема алкоголя не менее чем за 24 часа до сеансов воздействия, а также от кофеина в течение 12 часов. Два события будут разделены как минимум одной неделей. Субъекты отдыхают в течение 15 минут перед экспозицией.

После первоначального 15-минутного отдыха будут выполняться измерения различных сердечно-сосудистых конечных точек в исходном состоянии и в течение двух часов после обоих воздействий. Это будет сделано следующими методами:

Измерение сосудистой функции

Фотоплетизмография (ФПГ) Жесткость артерий является независимым показателем сосудистого повреждения и риска и лучше всего оценивается с помощью метода золотого стандарта скорости пульсовой волны (СРПВ). Однако этот метод технически сложен, требует специального оборудования (например, SphygmoCor) и обученного персонала. Пальцевая фотоплетизмография, однако, потенциально дает ту же информацию, что и PWV, и идеально подходит для непрерывного измерения жесткости артерий.

время распространения пульса (ВПП), интервал от систолического до диастолического пика пульсовой волны. PPT является перспективным маркером жесткости артерий и старения сосудов. В то же время ЭКГ и шумы тепла с помощью микрофона будут записаны, что упростит проверку достоверности анализа.

Микроциркуляция Ионофорез и лазерная спекл-контрастная визуализация (LSCI) Микроциркуляцию оценивают неинвазивным методом, при котором два вещества (ацетилхолин и нитропруссид) наносят в небольшой камере (0,5 мл) на поверхность кожи. Изменения микроциркуляции измеряют с помощью лазерной допплерографии. Метод абсолютно безвредный и безболезненный. Необычным, но правдоподобным побочным эффектом является местная временная кожная сыпь.

При каждом ударе сердца генерируется волна давления, достигающая даже самых периферических частей тела. Измеряя изменения в поглощении света, можно оценить растяжение (даже очень небольшое) периферических артерий и артериол в подкожной клетчатке, например, на кончике пальца. Микроциркуляцию также можно измерить с помощью лазерной спекл-контрастной визуализации (LSCI), которая представляет собой неинвазивный, полностью безболезненный метод оценки микроциркуляции кожи.

Артериальное давление Для измерения артериального давления и частоты сердечных сокращений будет использоваться полуавтоматический осциллометрический сфигмоманометр.

Образцы крови будут взяты в пробирки, содержащие 1/10 0,129 М цитрата натрия, ЭДТА и сыворотку на исходном уровне, через 0 часов, через 1 час и через 2 часа после воздействия. Затем плазму собирают после центрифугирования при 2000 g в течение 20 мин при комнатной температуре (КТ), а затем замораживают при -70°C до проведения анализа.

Измерение тромбообразования (T-TAS) T-TAS® (система анализа общего тромбообразования) — это средство оценки тромбообразования в условиях переменного потока с использованием небольшого образца крови.

Измерение котинина Уровни котинина будут измеряться в сыворотке с использованием доступного в продаже метода ELISA.

При прямой микроскопии капилляров ногтевого ложа одного из пальцев можно оценить капиллярный кровоток (скорость капиллярного кровотока, ОЦК, мм/с). Это абсолютно безболезненный и неинвазивный метод, который занимает около 15 минут.

Измерение МВ Плазму оттаивают и центрифугируют при 2000 g в течение 20 минут при комнатной температуре. Затем надосадочную жидкость повторно центрифугируют при 13 000 g в течение 2 минут при комнатной температуре. 20 мкл образца инкубируют в течение 20 минут в темноте с фаллоидином-Alexa-660 (Invitrogen, Пейсли, Великобритания), лактадгерином-FITC (Haematologic Technologies, Вермонт, США), CD42a-PE (тромбоциты-MP (PMP), BD, Clone Alma-16), CD45-PC7 (Leukocyte-MV (LMV), Beckman Coulter, Дублин, Ирландия) и CD144-APC (Endothelial-MV (EMV), диагностика АГ, Стокгольм, Швеция). PMV также помечены CD154-PE (CD40L, abcam, Кембридж, Великобритания), а EMV — CD62E (E-селектин, Beckman Coulter, Дублин, Ирландия). МВ измеряют методом проточной цитометрии на приборе Beckman Gallios (Калифорния, США). MV-gate определяется с использованием гранул Megamix (BioCytex, Марсель, Франция), которые представляют собой смесь гранул диаметром 0,5 мкм, 0,9 мкм и 3,0 мкм соответственно. МВ определяются как частицы размером менее 1,0 мкм, отрицательные к фаллоидину (чтобы исключить фрагменты клеточной мембраны) и положительные к лактадгерину. Конъюгат иммуноглобулина соответствующего изотипа (IgG1-FITC, IgG1-PE, IgG1-APC и IgG1-PC7), не обладающий реактивностью в отношении антигенов человека, используется в качестве отрицательного контроля для определения фонового шума цитометрического анализа. Абсолютное количество MV рассчитывается по следующей формуле: (подсчитанное MV x стандартные гранулы ⁄ л) ⁄ подсчитанные стандартные гранулы (FlowCount, Beckman Coulter).

Чтобы определить, высвобождаются ли MV из-за активации или апоптоза, MV маркируют SYTO 13. SYTO 13 (Molecular Probes) проницаем для клеток и имеет высокий выход флуоресценции при связывании с ДНК или РНК. Наша гипотеза состоит в том, что MV, высвобождаемые из апоптотических клеток, экспрессируют больше ДНК или РНК.

Прокоагулянтный эффект ВВ Эксперименты in vitro проводятся для изучения влияния ВВ на образование тромбина и относительного вклада отрицательно заряженной поверхности, обеспечиваемой ВВ. Кратковременно образцы плазмы оттаивают, и после этапов центрифугирования, описанных выше, мы дополнительно центрифугируем образцы (дважды 21 000g в течение 45 минут, КТ), чтобы получить осадок, обогащенный MV. Затем осадок добавляют к коммерческой плазме (Haemochrom, Diagnostica, Essen, Germany) без добавления TF или фосфолипидов. Генерацию тромбина в плазме определяют с помощью калиброванной автоматизированной тромбограммы (КАТ), первоначально описанной Hemker et al. Рассчитанная площадь под кривой представляет собой общее количество тромбина, образующегося с течением времени, и называется эндогенным тромбиновым потенциалом (ЭТП). Время до начала образования тромбина (время задержки), максимальная концентрация образования тромбина (пик тромбина) и время до максимального образования тромбина (время до пика тромбина) также оцениваются в CAT-анализе.