Gli effetti acuti dell'inalazione di sigarette elettroniche sulla funzione vascolare, sulla microcircolazione e sulla trombosi

Saranno inclusi ventidue fumatori occasionali sani, maschi e femmine o consumatori di snus (età 18-55, 10 sigarette al mese, 10 bustine di snus al mese). I soggetti della ricerca sono tenuti ad astenersi dall'assunzione di alcol e caffeina durante almeno 24 ore prima dell'esposizione. L'uso del tabacco (incluso il tabacco da fiuto umido svedese) o l'uso di sigarette elettroniche non è consentito nei 7 giorni precedenti l'esposizione.

Tutti i soggetti devono compilare una normale dichiarazione sanitaria.

In modo incrociato randomizzato, tutti i soggetti inaleranno vapore (30 boccate per 30 minuti) da una sigaretta elettronica, eVic-Primo SE (Shenzhen Joyetech Co., Ltd., Cina). in una stanza appositamente predisposta con adeguata ventilazione.

Ci sono molti produttori e distributori di e-liquid sul mercato. L'analisi indipendente del contenuto ha mostrato che la variazione di nicotina tra i lotti di e-liquid è bassa e che la quantità di nicotina dichiarata dal produttore spesso è corretta. Verrà utilizzato un liquido elettronico senza aromi (Valeo laboratori GmbH, Germania) senza e con nicotina (19 mg/ml). L'analisi del contenuto è disponibile gratuitamente sulla homepage del produttore (http://www.e-liquid-wholesale.com). Viene utilizzato un EC di terza generazione con impostazioni (Temperatura 230°C, Effetto 32 W, Resistenza 0,20 Ω).

I soggetti della ricerca sono tenuti ad astenersi dall'assunzione di alcol durante almeno 24 ore prima delle sequenze di esposizione, nonché di caffeina per 12 ore. Le due occasioni saranno separate da almeno una settimana. I soggetti riposano per 15 minuti prima dell'esposizione.

Dopo il riposo iniziale di 15 minuti, le misurazioni per vari endpoint cardiovascolari saranno eseguite al basale e fino a due ore dopo entrambe le esposizioni. Ciò avverrà con le seguenti modalità:

Misurazione della funzione vascolare

Fotopletismografia (PPG) La rigidità arteriosa è una misura indipendente del danno vascolare e del rischio, ed è meglio valutata con la tecnica gold standard della velocità dell'onda del polso (PWV). Tuttavia questo metodo è tecnicamente impegnativo e richiede attrezzature speciali (come SphygmoCor) e personale di studio istruito. La fotopletismografia delle dita, tuttavia, fornisce potenzialmente le stesse informazioni della PWV ed è ideale per la misurazione continua della rigidità arteriosa.

tempo di propagazione dell'impulso (PPT), l'intervallo dal picco sistolico a quello diastolico dell'onda del polso. PPT è un marcatore imminente per la rigidità arteriosa e l'invecchiamento vascolare. Allo stesso tempo, l'ECG ei suoni di calore verranno registrati da un microfono, rendendo l'analisi più facile da convalidare.

Microcircolazione Ionoforesi e laser speckle contrast imaging (LSCI) La microcircolazione viene valutata con un metodo non invasivo in cui due sostanze (acetilcolina e nitroprussiato) vengono applicate in una piccola camera (0,5 ml) sulla superficie della pelle. I cambiamenti nella microcircolazione sono misurati con il laser Doppler. Il metodo è completamente innocuo e indolore. Un effetto collaterale non comune ma plausibile è l'eruzione cutanea temporanea locale.

Ad ogni battito cardiaco si genera un'onda pressoria che raggiunge anche le parti più periferiche del corpo. Misurando le variazioni dell'assorbimento della luce è possibile valutare dilatazioni (anche molto piccole) nelle arterie periferiche e nelle arteriole del tessuto sottocutaneo, ad esempio nella punta del dito. La microcircolazione può anche essere misurata mediante imaging a contrasto laser speckle (LSCI), che è un metodo non invasivo completamente indolore per valutare la microcircolazione della pelle.

Pressione sanguigna Verrà utilizzato uno sfigmomanometro oscillometrico semiautomatico per misurare la pressione sanguigna e la frequenza cardiaca.

Prelievo di sangue I campioni di sangue verranno prelevati in provette contenenti 1/10 di citrato di sodio 0,129 M, EDTA e siero al basale, a 0 ore, 1 ora e 2 ore dopo l'esposizione. Il plasma viene successivamente raccolto dopo centrifugazione a 2 000 g per 20 minuti a temperatura ambiente (RT) e poi congelato a -70°C fino all'analisi.

Misurazione della formazione di trombi (T-TAS) T-TAS® (Total Thrombus-formation Analysis System) è un mezzo per valutare la formazione di trombi in condizioni di flusso variabile utilizzando un piccolo campione di sangue.

Misurazione della cotinina I livelli di cotinina saranno misurati nel siero utilizzando una tecnica ELISA disponibile in commercio.

Attraverso la microscopia diretta dei capillari del letto ungueale di una delle dita è possibile valutare il flusso sanguigno capillare (velocità capillare delle cellule del sangue, CBV, mm/s). Questo è un metodo completamente indolore e non invasivo che richiede circa 15 minuti per essere eseguito.

La misurazione del plasma MV viene scongelato e centrifugato a 2000 g per 20 minuti a temperatura ambiente. Il surnatante viene quindi nuovamente centrifugato a 13.000 g per 2 minuti a temperatura ambiente. 20 μl di campione vengono incubati per 20 minuti al buio con phalloidin-Alexa-660 (Invitrogen, Paisley, UK), lactadherin-FITC (Haematologic Technologies, Vermont, USA), CD42a-PE (Platelet-MP (PMP), BD, Clone Alma-16), CD45-PC7 (Leukocyte-MV (LMV), Beckman Coulter, Dublino, Irlanda) e CD144-APC (Endothelial-MV (EMV), diagnostica AH, Stoccolma, SWE). I PMV sono anche etichettati con CD154-PE (CD40L, abcam, Cambridge, UK) e gli EMV con CD62E (E-selectin, Beckman Coulter, Dublino, Irlanda). Le VM sono misurate mediante citometria a flusso su uno strumento Beckman Gallios (CA, USA). L'MV-gate viene determinato utilizzando sfere Megamix (BioCytex, Marsiglia, Francia), che è una miscela di sfere con diametri rispettivamente di 0,5 μm, 0,9 μm e 3,0 μm. Le MV sono definite come particelle di dimensioni inferiori a 1,0 μm, negative alla falloidina (per escludere frammenti di membrana cellulare) e positive alla lattaderina. L'immunoglobulina coniugata isotipica (IgG1-FITC, IgG1-PE, IgG1-APC e IgG1-PC7) senza reattività contro gli antigeni umani viene utilizzata come controllo negativo per definire il rumore di fondo dell'analisi citometrica. Il numero assoluto di MV è calcolato mediante la seguente formula: (MV contato x sfere standard ⁄ L) ⁄ sfere standard contate, (FlowCount, Beckman Coulter).

Per determinare se le MV vengono rilasciate a causa dell'attivazione o dell'apoptosi, le MV sono etichettate con SYTO 13. SYTO 13 (Molecular Probes) è permeabile alle cellule e ha un'elevata resa fluorescente quando legato a DNA o RNA. La nostra ipotesi è che le MV rilasciate dalle cellule apoptotiche esprimano più DNA o RNA.

Effetto pro-coagulante delle MV Vengono eseguiti esperimenti in vitro per studiare l'influenza delle MV sulla generazione di trombina e il contributo relativo della superficie caricata negativamente fornita dalle MV. Brevemente i campioni di plasma vengono scongelati e dopo le fasi di centrifugazione sopra descritte centrifughiamo ulteriormente i campioni (due volte 21.000 g in 45 min, RT) per ottenere un pellet di arricchimento MV. Il pellet viene quindi aggiunto al plasma commerciale (Haemochrom, Diagnostica, Essen, Germania) senza aggiunta di TF o fosfolipidi. La generazione di trombina nel plasma è determinata utilizzando il trombogramma automatico calibrato (CAT) come originariamente descritto da Hemker et al. L'area calcolata sotto la curva rappresenta la quantità totale di trombina generata nel tempo ed è chiamata potenziale endogeno di trombina (ETP). Nell'analisi CAT vengono valutati anche il tempo all'inizio della generazione di trombina (tempo di ritardo), la concentrazione massima della generazione di trombina (picco di trombina) e il tempo alla generazione massima di trombina (tempo al picco di trombina).