Os efeitos agudos da inalação de cigarro eletrônico na função vascular, microcirculação e trombose

Vinte e dois fumantes ocasionais saudáveis, do sexo feminino e masculino ou usuários de snus (idade 18-55, 10 cigarros por mês, 10 bolsas de snus por mês) serão incluídos. Os sujeitos da pesquisa são obrigados a abster-se da ingestão de álcool e cafeína durante pelo menos 24 horas antes da exposição. O uso de tabaco (incluindo rapé úmido sueco) ou uso de cigarro eletrônico não é permitido nos 7 dias anteriores à exposição.

Todos os indivíduos devem preencher uma declaração de saúde normal.

De forma cruzada aleatória, todos os indivíduos inalarão vapor (30 baforadas por 30 minutos) de um cigarro eletrônico, eVic-Primo SE (Shenzhen Joyetech Co., Ltd., China). em uma sala especialmente preparada com ventilação adequada.

Existem muitos fabricantes e distribuidores de e-líquidos no mercado. A análise de conteúdo independente mostrou que a variação de nicotina entre os lotes de e-líquido é baixa e que a quantidade de nicotina declarada pelo fabricante geralmente está correta. E-líquido sem aromatizantes (Valeo labs GmbH, Alemanha) sem e com nicotina (19 mg/ml) será usado. A análise de conteúdo está disponível gratuitamente na página inicial do fabricante (http://www.e-liquid-wholesale.com). Um EC de terceira geração é usado com configurações (Temperatura 230°C, Efeito 32 W, Resistência 0,20 Ω).

Os sujeitos da pesquisa são obrigados a abster-se da ingestão de álcool durante pelo menos 24 horas antes das sequências de exposição, bem como de cafeína por 12 horas. As duas ocasiões serão separadas por pelo menos uma semana. Os indivíduos descansam por 15 minutos antes da exposição.

Após o repouso inicial de 15 minutos, as medições para vários parâmetros cardiovasculares serão realizadas na linha de base e até duas horas após ambas as exposições. Isso será feito com os seguintes métodos:

Medição da função vascular

Fotopletismografia (PPG) A rigidez arterial é uma medida independente de dano e risco vascular e é melhor avaliada com a técnica padrão-ouro de velocidade de onda de pulso (PWV). No entanto, este método é tecnicamente exigente, exigindo equipamento especial (como o SphygmoCor) e pessoal de estudo instruído. A fotopletismografia digital, no entanto, fornece potencialmente as mesmas informações que a PWV e é ideal para a medição contínua da rigidez arterial.

tempo de propagação do pulso (PPT), o intervalo do pico sistólico ao diastólico da onda de pulso. PPT é um próximo marcador de rigidez arterial e envelhecimento vascular. Ao mesmo tempo, os sons de ECG e calor por um microfone serão gravados, tornando a análise mais fácil de validar.

Microcirculação Iontoforese e imagem de contraste com laser speckle (LSCI) A microcirculação é avaliada por um método não invasivo onde duas substâncias (acetilcolina e nitroprussiato) são aplicadas em uma pequena câmara (0,5 ml) na superfície da pele. Alterações na microcirculação são medidas com laser Doppler. O método é totalmente inofensivo e indolor. Um efeito colateral incomum, mas plausível, é a erupção cutânea temporária local.

A cada batimento cardíaco é gerada uma onda de pressão atingindo até as partes mais periféricas do corpo. Medindo as alterações na absorção de luz é possível avaliar distensões (mesmo muito pequenas) nas artérias periféricas e arteríolas no tecido subcutâneo, por exemplo na ponta do dedo. A microcirculação também pode ser medida por imagens de contraste de manchas a laser (LSCI), que é um método não invasivo e totalmente indolor para avaliar a microcirculação da pele.

Pressão arterial Um esfigmomanômetro oscilométrico semiautomático será utilizado para medir a pressão arterial e a frequência cardíaca.

Amostragem de sangue Amostras de sangue serão coletadas em tubos de ensaio contendo 1/10 0,129 M de citrato de sódio, EDTA e soro na linha de base, em 0 hora, 1 hora e 2 horas após a exposição. O plasma é posteriormente coletado após centrifugação a 2 000 g por 20 min em temperatura ambiente (RT) e depois congelado a -70 ° C até a análise.

Medição da formação de trombos (T-TAS) T-TAS® (Total Thrombus-formation Analysis System) é um meio de avaliar a formação de trombos durante condições de fluxo variável usando uma pequena amostra de sangue.

Medição de cotinina Os níveis de cotinina serão medidos no soro usando uma técnica ELISA disponível comercialmente.

Através da microscopia direta dos capilares do leito ungueal de um dos dedos, o fluxo sanguíneo capilar pode ser avaliado (velocidade das células sanguíneas capilares, CBV, mm/s). Este é um método totalmente indolor e não invasivo que leva cerca de 15 minutos para ser realizado.

Medição de MV O plasma é descongelado e centrifugado a 2.000 g por 20 minutos à temperatura ambiente. O sobrenadante é então re-centrifugado, a 13 000 g por 2 minutos à temperatura ambiente. 20 μl de amostra são incubados por 20 minutos no escuro com faloidina-Alexa-660 (Invitrogen, Paisley, Reino Unido), lactaderina-FITC (Haematologic Technologies, Vermont, EUA), CD42a-PE (Platelet-MP (PMP), BD, Clone Alma-16), CD45-PC7 (Leukocyte-MV (LMV), Beckman Coulter, Dublin, Irlanda) e CD144-APC (Endotelial-MV (EMV), diagnóstico AH, Estocolmo, SWE). Os PMVs também são rotulados com CD154-PE (CD40L, abcam, Cambridge, Reino Unido) e os EMVs com CD62E (E-selectin, Beckman Coulter, Dublin, Irlanda). As VMs são medidas por citometria de fluxo em um instrumento Beckman Gallios (CA, EUA). O MV-gate é determinado usando esferas Megamix (BioCytex, Marselha, França), que é uma mistura de esferas com diâmetros de 0,5 μm, 0,9 μm e 3,0 μm, respectivamente. As MVs são definidas como partículas com menos de 1,0 μm de tamanho, negativas para faloidina (para excluir fragmentos de membrana celular) e positivas para lactaderina. Imunoglobulina conjugada de isotipo compatível (IgG1-FITC, IgG1-PE, IgG1-APC e IgG1-PC7) sem reatividade contra antígenos humanos é usada como controle negativo para definir o ruído de fundo da análise citométrica. O número absoluto de MVs é calculado por meio da seguinte fórmula: (MV contado x esferas padrão ⁄ L) ⁄ esferas padrão contadas, (FlowCount, Beckman Coulter).

Para determinar se as MVs são liberadas devido à ativação ou apoptose, as MVs são marcadas com SYTO 13. SYTO 13 (Molecular Probes) é permeável às células e tem um alto rendimento fluorescente quando ligado ao DNA ou RNA. Nossa hipótese é que as MVs liberadas de células apoptóticas expressam mais DNA ou RNA.

Efeito pró-coagulante das MVs Experimentos in vitro são realizados para investigar a influência das MVs na geração de trombina e a contribuição relativa da superfície carregada negativamente fornecida pelas MVs. Resumidamente, as amostras de plasma são descongeladas e, após as etapas de centrifugação descritas acima, centrifugamos ainda mais as amostras (duas vezes 21.000 g em 45 min, RT) para obter um pellet enriquecido em MV. O pellet é então adicionado ao plasma comercial (Haemochrom, Diagnostica, Essen, Alemanha) sem adição de TF ou fosfolipídios. A geração de trombina no plasma é determinada usando o trombograma automático calibrado (CAT) conforme originalmente descrito por Hemker et al. A área calculada sob a curva representa a quantidade total de trombina gerada ao longo do tempo e é chamada de potencial de trombina endógena (ETP). O tempo para o início da geração de trombina (tempo de atraso), concentração máxima de geração de trombina (pico de trombina) e tempo para geração máxima de trombina (tempo para pico de trombina) também é avaliado na análise CAT.