Identyfikacja wczesnych predyktorów krwotoku płodowo-matczynego

1. Wstęp:

   Celem tego badania jest identyfikacja potencjalnych klinicznych predyktorów krwotoku płodowo-matczynego (FMH) i opracowanie strategii badań przesiewowych w celu identyfikacji ciąż dotkniętych tym schorzeniem, zanim płód zostanie zagrożony ciężką niedokrwistością.

   Krwawienie płodowo-matczyne to stan, w którym bariera łożyskowa zawodzi i płód „krwawi” do krążenia matki. Prawidłowo funkcjonujące łożysko umożliwia przenoszenie składników odżywczych i produktów przemiany materii między matką a płodem, jednocześnie utrzymując oddzielenie komórkowych składników krwi. Nierzadko zdarza się, że niewielkie ilości krwi płodu przedostają się do krążenia matki bez niekorzystnego wpływu na płód. W rzeczywistości łagodny FMH można wykryć nawet w 75% normalnych ciąż. Jednak w około 3 na 1000 ciąż objętość krwi płodu przeniesiona do matki powoduje klinicznie istotną anemię u płodu. Niedokrwistość płodu może powodować znaczną chorobowość i śmiertelność. U płodów, które przeżyły ciężką niedokrwistość, często dochodzi do niepełnosprawności na całe życie.

   Rozpoznanie FMH jest najczęściej stawiane po wystąpieniu niekorzystnego wyniku dla płodu lub noworodka, wskazującego na potrzebę wykonania badań. Wczesne czynniki ryzyka FMH nie są znane. Sugerowano kliniczne predyktory FMH, ale nie zostały one potwierdzone w badaniu retrospektywnym. Obecny standard badań pielęgnacyjnych FMH, test wymywania kwasem Kleihauera-Betke (KB), jest pracochłonny i czasochłonny, a przez to kosztowny. Ponadto test KB jest zależny od obserwatora i może na niego znacząco wpływać różnica w przygotowaniu próbki. Nie istnieje żaden protokół przesiewowy w kierunku FMH z automatycznymi testami laboratoryjnymi, który byłby odpowiedni do stosowania w ogólnej populacji ciężarnych.

   Cel szczegółowy: Określenie odpowiedniego protokołu laboratoryjnego do diagnozowania krwotoku płodowo-matczynego za pomocą badania prospektywnego oraz pilotażowe badanie mające na celu określenie wczesnych klinicznych czynników prognostycznych łagodnego krwotoku matczynego.

2. Tło i znaczenie Krwotok płodowo-matczyny występuje, gdy normalny przepływ krwi w łożysku zostaje zakłócony, a komórkowe składniki krwi płodu przedostają się do krążenia matki. Zdrowe łożysko umożliwia przenoszenie rozpuszczonych substancji między matką a płodem, jednocześnie utrzymując oddzielenie składników komórkowych obu układów krążenia. Filtr łożyskowy często „przecieka” podczas normalnej ciąży, co powoduje przenoszenie małych objętości krwi pełnej płodu do krwioobiegu matki. Objętość krwi płodu poniżej 1 ml można wykryć nawet w 75% ciąż. Uważa się, że taka objętość utraty krwi jest klinicznie nieistotna dla płodu. Ciężkie FMH z dużą objętością krwi przenoszonej od płodu do matki występuje rzadziej. Chociaż dokładna objętość transferu krwi potrzebna do zaklasyfikowania FMH jako „ciężkiego” jest przedmiotem dyskusji, jasne jest, że znaczny ostry lub przewlekły krwotok prowadzi do niekorzystnych wyników okołoporodowych. Szacunki dotyczące częstości występowania ciężkiego FMH są różne, głównie z powodu braku kompleksowych badań epidemiologicznych dotyczących tej choroby. Szacunki oparte na badaniach przesiewowych w kierunku alloimmunizacji Rh u kobiet Rho(d) ujemnych sugerują, że ciężkie FMH występuje w 1-3 na 1000 ciąż, ale odpowiada za prawie 14% niewyjaśnionych zgonów płodów. Duża objętość FMH może spowodować ciężką niedokrwistość płodu. Chociaż niedokrwistość płodu może objawiać się in utero z rozpoznanym obrzękiem płodu lub wewnątrzmacicznym ograniczeniem wzrostu, częściej nie ma zewnętrznych objawów ciężkiej niedokrwistości związanej z FMH przed porodem martwego płodu, zagrożeniem płodu podczas porodu lub krytyczną chorobą noworodka. Bezpośrednie następstwa ciężkiego FMH u noworodków, które przeżyły poród, obejmują wyniszczające choroby, takie jak utrzymywanie się krążenia płodowego, wstrząs hipowolemiczny i encefalopatia niedotlenieniowo-niedokrwienna. Ostateczne szkodliwe skutki obejmują wysokie wskaźniki upośledzenia umysłowego, porażenie mózgowe, dewastację neurologiczną i śmierć. Pomimo tych konsekwencji i podejrzewanego niedawnego wzrostu częstości występowania ciężkiego FMH, wczesne czynniki prognostyczne ciężkiego FMH pozostają nieznane, aw ponad 80% przypadków nie można zidentyfikować przyczyny krwotoku. Nie wyjaśniono matczynych lub ciążowych czynników ryzyka odpowiednich do wczesnego badania przesiewowego lub diagnozy ciężkiego FMH w ogólnej populacji ciężarnych. W przypadku rozpoznania niedokrwistości płodowej spowodowanej FMH, jeśli zostanie ona rozpoznana przed porodem, można ją skutecznie leczyć poprzez transfuzję wewnątrzmaciczną płodu i poród przed rozpoczęciem porodu. , Wyniki leczenia niedokrwistości płodowej za pomocą transfuzji płodowej, a nawet wielokrotnej transfuzji płodowej, są zachęcające. Zatem empiryczne predyktory FMH dawałyby natychmiastową obietnicę poprawy wyników klinicznych. Społeczne i finansowe koszty zarówno początkowej intensywnej terapii, jak i długoterminowej opieki przewlekłej nad dziećmi z niepełnosprawnością poznawczą i ruchową wynikającą z FMH są znaczne. Istnieje znaczna potrzeba wczesnej identyfikacji ryzyka i praktycznej strategii badań przesiewowych w celu złagodzenia ludzkich i ekonomicznych kosztów ciężkiej FMH.

Potwierdzone kliniczne predyktory FMH obejmują zmniejszoną ruchomość płodu, zapis sinusoidalnego tętna płodu i obrzęk płodu. Markery te nie są przydatne w zapobieganiu zdarzeniom niepożądanym wynikającym z FMH, ponieważ każdy z nich oznacza rozpoznaną ciężką niedokrwistość płodu. Cechy matki, które rzekomo zwiększają ryzyko FMH, obejmują nadciśnienie, odklejenie łożyska, nadużywanie substancji i uraz. Zostały one ocenione w retrospektywnym badaniu martwych urodzeń w badaniu z 1999 roku. Żaden nie był istotnie związany z FMH. Charakterystykę kliniczną z podejrzeniem związku z FMH oceniano w badaniu z 2004 r. z udziałem kobiet Rho(d)-ujemnych. Tylko ciąża bliźniacza była istotnie związana z FMH. Nie wiadomo, czy częstość występowania FMH w ciążach mnogich jest większa niż w ciążach pojedynczych. Nie opublikowano prospektywnego ani retrospektywnego badania epidemiologicznego dotyczącego FMH w ogólnej populacji ciężarnych. Nie istnieje opis epidemiologiczny obejmujący spektrum (łagodne, umiarkowane, ciężkie) FMH. Żadna seria patologii łożyska pobrana z przypadków FMH nie została zakończona.

Obecnie, nawet jeśli zagrożone ciąże warte badań przesiewowych zostaną zidentyfikowane przed katastrofalnymi wynikami, badania laboratoryjne w kierunku FMH nie są proste. Najczęściej stosowanym testem laboratoryjnym do wykrywania i ilościowego określania objętości krwi płodowej w krążeniu matki jest test wymywania kwasem Kleihauera-Betke (KB). Odczynniki do testu KB są stosunkowo niedrogie, ale test jest zależny od operatora i pracochłonny, co czyni go nieatrakcyjnym kandydatem do zastosowania w rozszerzonych badaniach przesiewowych. Test opiera się na fakcie, że kwaśny eluent spowoduje lizę kruchych erytrocytów matki, podczas gdy hemoglobina płodowa stabilizuje erytrocyty płodu. Pobiera się krew matki i poddaje działaniu kwaśnego eluentu. Pozostałe nienaruszone komórki płodowe barwi się i liczy. Szacunki całkowitej objętości krwi matki i płodu są następnie wykorzystywane do obliczenia objętości FMH. Na test KB ma wpływ obchodzenie się z próbką, jest zależny od technika i może być niedokładny, jeśli objętość krwi pacjenta lub morfologia krwi nie są podobne do stosowanych standardowych szacunków. Przypuszcza się, że wykorzystanie wzrostu i masy ciała matki do oszacowania objętości krwi matki dla każdej badanej osoby może poprawić dokładność testów KB. Ta metoda nie jest powszechnie stosowana i nie została zwalidowana w ogólnej populacji ciężarnych. Taka „poprawiona baza wiedzy” wymaga dalszego zbadania.

Dodatkowym testem, który został zbadany w celu uniknięcia niektórych pułapek testów KB, jest ocena poziomu alfa-fetoproteiny w surowicy matki (AFP). Stężenie AFP pochodzącego z płodu w krążeniu matki można wykorzystać do oszacowania objętości FMH. Ponieważ jednak poziomy AFP różnią się w trakcie i między ciążami, testowanie AFP jest najbardziej przydatne, gdy porównuje się wiele poziomów uzyskanych w trakcie ciąży. Zdecydowana większość kobiet w ciąży w Stanach Zjednoczonych przechodzi testy AFP w drugim trymestrze ciąży w ramach „poczwórnych” lub „potrójnych” badań przesiewowych pod kątem aneuploidii płodu i wad cewy nerwowej. Chociaż teoretycznie wykonalne, żadne opublikowane raporty nie dokumentują wykorzystania tego podstawowego poziomu AFP w drugim trymestrze ciąży do wykrywania FMH po dodatkowym badaniu AFP bliżej terminu porodu.

Najdokładniejszy dotychczas opracowany pomiar FMH uzyskuje się za pomocą cytometrii przepływowej (FC) przy użyciu przeciwciał swoistych dla hemoglobiny komórek płodowych. Komórki muszą być chemicznie przepuszczalne, aby umożliwić ekspozycję przeciwciała FC na hemoglobinę wewnątrzkomórkową przed analizą. Ponadto udokumentowano, że FC przy użyciu przeciwciał monoklonalnych przeciwko hemoglobinie płodowej pozwala na wiarygodną diagnozę FMH > 0,1% w ogólnej populacji klinicznej. Jest to mniej czułe niż test KB, gdy jest wykonywany w standardowych warunkach klinicznych. Wreszcie, zgodnie z obecną praktyką, FC przy użyciu przeciwciał przeciwko hemoglobinie płodowej jest czasochłonne i kosztowne. Dlatego ten test nie jest obecnie odpowiedni do badań przesiewowych na dużą skalę.

Nie opublikowano serii patologii łożyska związanych z FMH. Ponieważ uważa się, że FMH jest chorobą związaną z niewydolnością łożyska, systematyczny przegląd łożysk ciąż dotkniętych FMH może wyjaśnić patogenezę tego typu nieprawidłowości łożyska.

Krwawienie płodowo-matczyne jest niedostatecznie zbadaną jednostką chorobową, która wiąże się ze znaczną chorobowością i śmiertelnością. Badanie to ma na celu identyfikację wczesnych klinicznych predyktorów choroby i opracowanie zautomatyzowanej strategii przesiewowej odpowiedniej do szerokiego zastosowania. Aby w pełni rozwiązać ten problem, zastosowane zostaną standardowe techniki epidemiologiczne w połączeniu z adaptacją istniejących technik laboratoryjnych.

4. Metody: Aby osiągnąć te cele szczegółowe, proponujemy (1) przetestowanie naszych zautomatyzowanych procedur badań laboratoryjnych w kierunku FMH oraz (2) pilotaż protokołu wykorzystującego nowatorskie zautomatyzowane procedury badań laboratoryjnych w celu identyfikacji par noworodek-matka dotkniętych FMH w celu identyfikacji wczesnych klinicznych predyktorów FMH. Jest to pilotażowe, prospektywne, zagnieżdżone badanie kliniczno-kontrolne.

We współpracy z laboratorium Fizjologii Krwinek Czerwonych w Centrum Krwi w Nowym Jorku opracowaliśmy prototyp automatycznego testu FMH przy użyciu cytometrii przepływowej i odczynników dostępnych w Centrum Krwi w Nowym Jorku.

Do tego badania pilotażowego zostanie wybrana dogodna próbka kobiet przyjętych na salę porodową Centrum Medycznego Mount Sinai. Kwalifikujące się kobiety będą przyjmowane do porodu o czasie (poród między 37 0/7 a 41 6/7 tygodniem od ostatniej miesiączki). Matki niosące płody ze stwierdzoną wadą płodu zostaną wykluczone. Kobiety ze stanem przedrzucawkowym lub anomalią zagnieżdżenia się łożyska (accreta, przedwczesne odklejenie) zostaną uwzględnione, ponieważ stany te mogą narazić ciążę na ryzyko FMH, ale obecnie nie wskazują na konieczność monitorowania ciąży pod kątem niedokrwistości płodu. Uwzględnione zostaną ciąże mnogie. Kobiety, które nie są w stanie ukończyć procesu wyrażania zgody z powodu prawdopodobnego przedwczesnego porodu, poważnego dyskomfortu podczas porodu lub zagrożenia płodu wymagającego natychmiastowej interwencji położniczej, zostaną wykluczone. Każda kobieta zostanie włączona do badania przed wymaganym pobraniem krwi przed porodem i/lub podaniem kroplówki, tak aby można było pobrać badaną próbkę krwi z klinicznie wskazanym upuszczeniem krwi. Próbki do badań będą przechowywane w banku do badania partii próbek pochodzących z ciąż będących przedmiotem zainteresowania.

Nie wszystkie kobiety oddające krew w ramach tego badania będą miały badaną krew pod kątem objawów FMH. Chociaż przed porodem od kwalifikujących się kobiet, które wyrażą zgodę, zostanie pobrane 5 ml krwi, zbadane zostaną tylko próbki wybranych do naszej stratyfikowanej populacji próbek na podstawie hematokrytu noworodków (HCT). Cała pobrana krew matki zostanie utrwalona i/lub zamrożona natychmiast po upuszczaniu krwi do późniejszej analizy wsadowej.

Kwalifikujące się noworodki matek wyrażających zgodę otrzymają 0,5 ml (około 3 kropli) krwi w celu oznaczenia hematokrytu w czasie wymaganego pobrania krwi w ramach programu badań przesiewowych noworodków stanu Nowy Jork w drugim dniu życia. Kwalifikacja zostanie określona na podstawie braku historii klinicznej innej niż FMH w celu wyjaśnienia niedokrwistości noworodków. Kliniczne wskaźniki niedokrwistości niezwiązanej z FMH, które będą traktowane jako kryteria wykluczenia, obejmują chorobę hemolityczną (z powodu znanego uczulenia na czynnik Rh, Kell itp. lub pozytywny wynik testu Coombsa), znany znaczny ucisk pępowiny w czasie porodu (wypadnięcie pępowiny, ciasne wokół pępowiny) szyi lub tułowia), zespół transfuzji między bliźniętami rozpoznany jako niedokrwistość u dawcy-bliźniaka i policytemię u biorcy-bliźniaka oraz znana utrata krwi u noworodka (rozwarcie pępowiny, rana szarpana). Noworodki, u których zmierzono hematokryt w ciągu pierwszych 48 godzin życia ze wskazania klinicznego, nie będą miały dodatkowego pobrania krwi do tego badania; wykorzystane zostaną wyniki próbek ze wskazaniami klinicznymi. Wszystkie noworodki zakwalifikowanych matek zostaną poddane badaniu HCT. Wszystkie pary matka-dziecko z wykazaną niedokrwistością noworodków (HCT ≤ 50%) zostaną włączone do kohorty pilotażowej. W przypadku ciąży mnogiej do analizy zostanie włączone całe rodzeństwo, jeśli któreś z nich wykaże anemię. Dwadzieścia pięć procent noworodków z HCT powyżej 50% zostanie również włączonych do kohorty pilotażowej (co czwarty badany z HCT > 50%). Ta strategia pobierania próbek pozwoli na ocenę całego spektrum morfologii krwi noworodków, z nadreprezentacją osób z niedokrwistością.

Krew matczyna osób z kohorty badania przechodzi wiele testów na obecność FMH, w tym FC, AFP i KB. Cytometria przepływowa zostanie przeprowadzona w New York Blood Center. Określenie poziomu AFP i testy KB zostaną przeprowadzone przez laboratorium szpitala Mount Sinai.

Próbki krwi matki zostaną odpowiednio utrwalone w momencie pobrania, a następnie zamrożone i co tydzień badane partie. Wszelkie klinicznie wskazane badania FMH będą wykonywane niezależnie na próbkach krwi pobranych po porodzie i nie będą uwzględniane w naszej analizie. Wszystkie dostępne wyniki testów AFP pierwszego trymestru zostaną uzyskane dla matek kohortowych. Zostaną zebrane dane antropometryczne w celu skorygowania wyników badań szacowanej objętości krwi matki na podstawie wzrostu i masy ciała matki. Dokładność różnych metod badawczych w przewidywaniu objętości krwi płodu w krążeniu matki zostanie określona przez porównanie z próbkami KB skorygowanymi o rzeczywistą, a nie szacunkową objętość krwi matki.

Wszystkie łożyska badanych osób zostaną utrwalone i przetrzymane przez laboratorium patologiczne przez standardowy okres jednego tygodnia po porodzie. W trzydziestu ciążach wybranych metodą warstwowego pobierania próbek w oparciu o ciężkość FMH łożysko ciąży zostanie poddane pełnemu badaniu histopatologicznemu. Zostaną zastosowane standardowe techniki badania, w tym badanie ogólne i mikroskopowe.

Po zidentyfikowaniu matek z kohorty badawczej zbierzemy medyczną, społeczną, środowiskową i pełną historię ciąży poprzez ukierunkowany wywiad. Elementy o szczególnym znaczeniu będą obejmować te, które w literaturze przypuszczano, że są związane z FMH. Czynniki podejrzewane w piśmiennictwie jako związane z FMH obejmują nadciśnienie u matki w czasie ciąży, stan przedrzucawkowy u matki, uraz matki w czasie ciąży, odklejenie łożyska i ciążę mnogą. Narzędzie ankietowe zbada te elementy historii matki, a także przeprowadzi szeroki przegląd historii środowiskowej i społecznej w celu zidentyfikowania nierozpoznanych klinicznych predyktorów FMH. Podczas poporodowego pobytu w szpitalu pacjentki zostaną przesłuchane. Dane posłużą do identyfikacji wczesnych czynników ryzyka FMH.

Czynniki ryzyka zostaną zidentyfikowane za pomocą modelowania regresji logistycznej z wielopoziomowym wynikiem, w którym FMH jest kodowana jako nieobecna (referencyjna), łagodna lub ciężka, generując osobne ilorazy szans dla łagodnej i ciężkiej FMH. Alternatywne podejścia laboratoryjne do identyfikacji FMH zostaną porównane poprzez zbadanie zgodności przy użyciu statystyki kappa i kwantyfikację zgodności między kategoriami.