Wieloelektrodowa agregometria i oporność na klopidogrel

Celem tego badania jest ocena zdolności nowego urządzenia POC, agregometrii wieloelektrodowej (Multiplate, Dynabyte, Monachium, Niemcy) do wykrywania oporności na klopidogrel i przewidywania wyniku klinicznego u pacjentów z cukrzycą typu 2 (T2DM) i chorobą wieńcową choroby tętnic (CAD) w porównaniu z agregometrią przepuszczalności światła (LTA), która jest uważana za złoty standard badania funkcji płytek krwi [7]. 280 chorych na T2DM w wieku od 20 do 75 lat leczonych doustną i/lub pozajelitową terapią hipoglikemizującą przez co najmniej 1 miesiąc z rozpoznaną angiograficznie chorobą wieńcową na podstawie wcześniejszego uniesienia odcinka ST, ostrego zespołu wieńcowego bez uniesienia odcinka ST lub niestabilnej dławicy piersiowej leczeni klopidogrelem w dawce 75 mg/dobę w połączeniu z codzienną terapią aspiryną per os przez co najmniej 7 dni po udokumentowaniu choroby wieńcowej, zostaną zrekrutowani. Rekrutacja pacjentów odbywać się będzie na Drugim Uniwersyteckim Oddziale Kardiologii Szpitala Uniwersyteckiego „Attiko” w Atenach w Grecji. Ocena wyjściowa będzie obejmowała rejestrację danych demograficznych, wywiadu medycznego, czynników ryzyka sercowo-naczyniowego, parametrów hematologicznych, liczby chorych naczyń, liczby stentowanych naczyń, przebytego zawału mięśnia sercowego (MI), wcześniejszej rewaskularyzacji, frakcji wyrzutowej i jednocześnie stosowanych leków. Pacjenci z niewydolnością nerek (stężenie kreatyniny > 2,5 mg/dl) lub wątroby (stężenie bilirubiny > 2 mg/dl), chorobą nowotworową, stosowaniem leków wpływających na czynność płytek krwi, skazą krwotoczną w wywiadzie, liczbą płytek krwi < 100 x 109/l oraz hematokryt < 28% zostanie wykluczony. Protokół zostanie zatwierdzony przez instytucjonalną komisję rewizyjną Szpitala Uniwersyteckiego „Attiko”, a wszyscy pacjenci wyrażą pisemną świadomą zgodę przed poddaniem się jakiejkolwiek procedurze badawczej lub otrzymaniem jakiegokolwiek badanego leczenia.

Pomiary czynności płytek krwi zostaną przeprowadzone w momencie włączenia do badania. Pacjenci zostaną zidentyfikowani jako słabo lub dobrze reagujący na klopidogrel. Pierwszorzędowy punkt końcowy zostanie zdefiniowany jako zgon z przyczyn sercowo-naczyniowych, zawał mięśnia sercowego niezakończony zgonem, zakrzepica w stencie, udar niedokrwienny mózgu, pilna ponowna hospitalizacja z powodu ostrego zespołu wieńcowego i/lub rewaskularyzacja podczas rocznej obserwacji. Epizody dużych krwawień zgodnie z kryteriami PLATO będą rejestrowane podczas obserwacji [8].

Oceniona zostanie zdolność obu metod do wykrywania oporności na klopidogrel oraz potencjalna korelacja między odpowiedzią na leczenie przeciwpłytkowe a wynikiem klinicznym. Równolegle pacjenci o podobnej charakterystyce, ale leczeni prasugrelem lub tikagrelorem, będą stanowić grupę kontrolną o tej samej wielkości próby.

Analiza czynności płytek krwi Analiza czynności płytek krwi zostanie przeprowadzona w Pracowni Hematologii i Oddziału Banku Krwi Szpitala Uniwersyteckiego „Attiko”. Próbki krwi będą pobierane z żyły łokciowej od 2 do 4 godzin po przyjęciu terapii przeciwpłytkowej. Pierwsze 2 do 4 ml krwi zostanie odrzucone, aby uniknąć spontanicznej aktywacji płytek krwi, aw ciągu dwóch godzin od pobrania zostaną przeprowadzone testy czynnościowe płytek krwi.

Agregometria przepuszczalności światła (LTA) Próbkę krwi pełnej pobiera się w 3,8% cytrynianie trisodowym i odwirowuje przy 200 g przez 10 minut w celu uzyskania osocza bogatopłytkowego (PRP). Pozostała próbka zostanie ponownie odwirowana przy 2000 g przez 15 minut w celu uzyskania osocza ubogiego w płytki krwi (PPP). Liczba płytek krwi zostanie dostosowana do wartości pomiędzy 200 000/μl a 300 000/μl za pomocą PPP. Agregacja zostanie przeprowadzona przy użyciu agregometru Biodata-PAP-4 (Bio/Data Corporation, PA, USA). Linia 100% zostanie ustalona przy użyciu PPP, a linia podstawowa 0% ustalona za pomocą PRP przed dodaniem agonisty. Stosowanym agonistą będzie ADP 2,0 x 10-5 M (Bio/Data Corporation, PA, USA). Procedura testowa zostanie przeprowadzona zgodnie z wcześniejszym opisem [9]. W skrócie, 0,45 ml PRP przenosi się do kuwety inkubowanej w temperaturze 37°C przez 3 minuty. Następnie do PRP dodaje się 0,05 ml agonisty i pozostawia się wzór agregacji na 6 minut. Agregację płytek krwi określono jako maksymalną procentową zmianę transmitancji światła od wartości wyjściowej, stosując PPP jako odniesienie. Wartość odcięcia > 59% agregacji po stymulacji 20 mikroM ADP zostanie zdefiniowana jako wskazująca na wysoką reaktywność płytek krwi w trakcie leczenia [10]. Inne badane parametry to późna agregacja i stopień dezagregacji.

Agregometria wieloelektrodowa (MEA) Agregacja płytek krwi w pełnej krwi zostanie oceniona za pomocą MEA przy użyciu agregometru impedancji (Multiplate, Dynabyte, Monachium, Niemcy). Próbki zostaną pobrane do probówek z 3,2% cytrynianem i poddane analizie w ciągu pół do dwóch godzin po pobraniu krwi, zgodnie z instrukcjami producenta. Agregacja płytek będzie indukowana przez ADP w końcowym stężeniu 6,5 µM. Każda jednorazowa cela testowa zawiera dwie pary elektrod, umożliwiając w ten sposób dwa jednoczesne pomiary. Agregacja zostanie zgłoszona jako pole pod krzywą (AUC), zintegrowana miara prędkości agregacji i maksymalnej agregacji. Wartość odcięcia dla HRPR według MEA (> 468 arbitralnych jednostek agregacji/min w odpowiedzi na ADP w analizatorze Multiplate) została zdefiniowana zgodnie z niedawno opublikowanym konsensusem dotyczącym definicji wysokiej reaktywności płytek krwi podczas leczenia na adenozynodifosforan [11].

Metody statystyczne

1. Główny punkt końcowy:

   W tym prospektywnym badaniu kohortowym pierwszorzędowy punkt końcowy zostanie zdefiniowany jako zgon z przyczyn sercowo-naczyniowych, zawał mięśnia sercowego niezakończony zgonem, zakrzepica w stencie, udar niedokrwienny mózgu, pilna ponowna hospitalizacja z powodu ostrego zespołu wieńcowego i/lub rewaskularyzacja podczas rocznej obserwacji okres. Epizody dużego krwawienia zgodnie z kryteriami PLATO będą rejestrowane podczas obserwacji.

2. Opisowe statystyki:

   Zostaną one przedstawione jako średnie ± SD, mediany i rozstępy międzykwartylowe (IQR) lub procenty, jeśli to właściwe.

3. Porównanie danych wyjściowych (dane demograficzne, historia medyczna, czynniki ryzyka sercowo-naczyniowego, parametry hematologiczne, liczba chorych naczyń, przebyty zawał mięśnia sercowego, poprzednia rewaskularyzacja, frakcja wyrzutowa i jednocześnie stosowane leki) pomiędzy osobami reagującymi i niereagującymi na klopidogrel:

   Najpierw użyjemy testu Shapiro-Wilka do sprawdzenia normalności rozkładów danych. Zmienne ciągłe będą porównywane za pomocą dwupróbkowego testu t Studenta (gdy rozkład jest normalny) lub nieparametrycznego dwupróbkowego testu sumy rang Wilcoxona (Manna-Whitneya) (gdy rozkład zostanie znaleziony nienormalne). Zmienne kategoryczne zostaną porównane za pomocą testu chi-kwadrat Pearsona.

4. Zgodność dwóch metod wykrywania oporności na klopidogrel:

   Zgodność między „Multiplate” i „LTA indukowaną przez ADP” zostanie określona przez statystyki kappa i odpowiednie wartości p. Uważa się, że wartości Kappa < 0,20 wskazują na słabą zgodność, od 0,21 do 0,40 wskazują na zadowalającą zgodność, od 0,41 do 0,60 wskazują na umiarkowaną zgodność, od 0,61 do 0,80 wskazują na dobrą zgodność, a >0,81 na bardzo dobrą zgodność.

5. Korelacja oporności laboratoryjnej z wynikiem klinicznym:

   Analiza regresji logistycznej zostanie zastosowana w celu oceny, czy metody wykrywania oporności na klopidogrel („wielopłytkowa” i „LTA indukowana przez ADP”) są związane z wynikiem klinicznym (punkt końcowy). Aby ocenić, czy te powiązania są niezależne, pewne współzmienne, które są dobrze znanymi czynnikami ryzyka (tj. czynniki ryzyka sercowo-naczyniowego, liczba chorych naczyń, przebyty zawał mięśnia sercowego, poprzednia rewaskularyzacja itp.) zostaną uwzględnione w modelach regresji logistycznej wielu zmiennych. Przedstawione zostaną surowe i skorygowane ilorazy szans (OR) oraz odpowiadające im 95% przedziały ufności (CI).

6. Poziom istotności:

   W przypadku testowania hipotez poziom prawdopodobieństwa < 0,05 zostanie uznany za istotny statystycznie. Wszystkie testy statystyczne będą dwustronne.

7. Oprogramowanie statystyczne:

   Oprogramowanie Stata będzie używane do wszystkich analiz statystycznych (Stata Corp., College Station, TX, USA).

8. Obliczenie wielkości próbki:

W celu obliczenia wielkości próby wysuwamy hipotezę, że oporność na klopidogrel CR(+) jest bardziej rozpowszechniona wśród pacjentów z T2DM w porównaniu z pacjentami bez cukrzycy [12, 13]; jednocześnie w grupie DM pacjentów z opornością na klopidogrel występuje zwiększone prawdopodobieństwo wystąpienia niepożądanych incydentów sercowo-naczyniowych [14]. Wykazano, że 13% ogólnej populacji pacjentów z cukrzycą typu 2 cierpi na poważne niepożądane zdarzenia sercowo-naczyniowe (MACE) [w tym zgon wtórny do przyczyny sercowo-naczyniowej, zawał mięśnia sercowego z uniesieniem odcinka ST (STEMI), zawał mięśnia sercowego bez uniesienia odcinka ST ( NSTEMI) i niestabilna dławica piersiowa (UA) i udar mózgu]; liczba ta wzrasta do 38% wśród chorych na T2DM z opornością na klopidogrel, którzy kontynuują leczenie klopidogrelem [15]. Wielkość próby potrzebna do wykrycia tej różnicy we wskaźnikach zdarzeń niepożądanych – między pacjentami z cukrzycą CR(+) i CR(-) – z dwustronnym ryzykiem 5% i ryzykiem b 20% (moc 80%) będzie miała na 101 pacjentów [40 w grupie CR(+) i 61 w grupie CR(-)]. Jeśli przyjmiemy współczynnik ścierania na poziomie 10%, wielkość próby należy dodatkowo zwiększyć do 111 pacjentów [44 w grupie CR(+) i 67 w grupie CR(-)]. Wreszcie, biorąc pod uwagę, że oporność na klopidogrel wśród pacjentów z T2DM można oszacować na około 40% [16-18], początkowa próba wszystkich pacjentów z cukrzycą powinna być 2,5 razy większa, czyli 278 pacjentów (111 opornych na klopidogrel i 167 opornych na klopidogrel wrażliwy). Oprogramowanie statystyczne G*Power 3.1.3 (Kilonia, Niemcy) została wykorzystana do obliczenia wielkości próby.