Wpływ śródporodowej profilaktyki antybiotykowej (IAP) na rozwój mikroflory jelitowej noworodka. (MICROBIOTA-SO)

Po urodzeniu przewód pokarmowy noworodka jest szybko kolonizowany przez bakterie matczyne i środowiskowe; pierwszymi kolonizatorami są na ogół tlenowce i fakultatywne beztlenowce, po których następują bezwzględne beztlenowce (np. Bifidobacterium spp., Bacteroides spp. i Clostridium spp.). Na skład mikroflory jelitowej wpływa kilka czynników, takich jak sposób porodu, wiek ciążowy, mikroflora jelitowa i pochwowa matki, sposób karmienia, hospitalizacja po urodzeniu oraz stosowanie antybiotyków i probiotyków.

Mikroflora jelitowa noworodków urodzonych naturalnie i karmionych wyłącznie piersią jest uważana za idealnie zdrową, z niską liczbą C. difficile i E. coli oraz dużą liczbą Bidifobacteria i Lactobacilli, które pozytywnie wpływają na zdrowie gospodarza poprzez aktywację komórek immunokompetentnych w przewodzie pokarmowym, promując wytwarzanie wydzielniczej IgA i zwiększając aktywność bakteriobójczą neutrofili i odporność komórkową, taką jak aktywność komórek NK.

Streptococcus grupy B (GBS) jest jedną z najważniejszych przyczyn infekcji noworodków i posocznicy. Niemowlęta urodzone drogą pochwową mogą nabyć GBS podczas porodu z pochwy, szyjki macicy lub odbytnicy matki, gdzie występuje u około 10-20% kobiet w ciąży. Od połowy lat 90. częstość występowania sepsy GBS o wczesnym początku jest znacznie zmniejszona dzięki wprowadzeniu powszechnych badań przesiewowych w kierunku GBS w późnej ciąży i wynikającej z tego śródporodowej profilaktyki antybiotykowej (IAP) u kobiet z GBS-dodatnim.

Ostatnie dane sugerują, że stosowanie antybiotyków we wczesnym okresie życia może zmienić komensalną mikroflorę jelitową, zaburzając w ten sposób równowagę między zdrowiem a chorobą w późniejszym życiu. Wpływ IAP na bakteryjną kolonizację jelita niemowlęcia nie został dokładnie zbadany. Co więcej, obecnie dostępne dane na ten temat w dużej mierze pochodzą z badań przeprowadzonych przy użyciu technik kulturowych; jednak na dokładne wyniki posiewów wpływa dobór odpowiednich pożywek, temperatura, zawartość tlenu i czas wzrostu, iz tego powodu zaledwie 10-50% wszystkich bakterii jelitowych daje się łatwo wyhodować. Techniki molekularne, oparte na amplifikacji genu 16S rybosomalnego bakteryjnego RNA w celu różnicowania taksonów prokariotycznych, zostały niedawno opracowane do badania mikroflory jelitowej, umożliwiając w ten sposób bardziej szczegółową charakterystykę zbiorowisk bakteryjnych niż standardowa kultura.

Wcześniej ocenialiśmy wpływ IAP na stosunkowo małą próbkę noworodków karmionych wyłącznie piersią, urodzonych drogą pochwową za pomocą technik molekularnych; w 7 dniu życia istniało kilka różnic w składzie mikrobiomu między niemowlętami narażonymi na IAP i nienarażonymi.

Celem niniejszej pracy jest zatem bardziej szczegółowa ocena tych różnic, rozszerzenie początkowej próby i obserwacja niemowląt do pierwszego miesiąca życia. Badany jest również wpływ rodzaju żywienia na skład mikrobiomu.

Do badania włączono zdrowe niemowlęta urodzone w terminie, z masą urodzeniową odpowiednią do wieku ciążowego, których matki zostały przebadane w kierunku GBS w 35-37 tygodniu ciąży.

Niemowlęta są wykluczone, jeśli:

• przedwcześnie urodzony lub mały/duży w stosunku do wieku ciążowego
• urodzony przez cesarskie cięcie
• matka otrzymywała jakikolwiek antybiotyk w ciągu 4 tygodni przed porodem;
• matczyna IAP jest wykonywana z powodów innych niż dodatni wynik GBS (tj. przedłużone pęknięcie błon u kobiet GBS-ujemnych);
• IAP matki jest niewystarczające;
• IAP matki wykonuje się z antybiotykami innymi niż ampicylina, takimi jak erytromycyna;
• niemowlę ma poważne wady wrodzone;
• u niemowlęcia pojawiają się objawy infekcji i/lub po urodzeniu było ono leczone antybiotykami;
• niemowlę ma poważne stany kliniczne, które stanowią przeciwwskazanie do udziału w badaniu.

Niemowlęta są przydzielane do dwóch grup w zależności od statusu GBS matki i IAP:

• Grupa IAP: niemowlęta urodzone przez matki GBS-dodatnie, które otrzymały odpowiednie IAP. Zgodnie z protokołem leczenia instytucjonalnego w profilaktyce GBS (zaczerpniętym z wytycznych CDC) ampicylinę podaje się dożylnie co 4 godziny do porodu (pierwsza dawka 2 g, kolejne dawki po 1 g). IAP uważa się za odpowiednie, jeśli matka otrzymała co najmniej dwie dawki ampicyliny przed porodem.
• Grupa kontrolna: niemowlęta urodzone przez matki GBS-ujemne, które nie były leczone antybiotykami przed/w czasie porodu.

Pisemną świadomą zgodę uzyskuje się od rodzica/opiekuna prawnego każdego niemowlęcia, gdy niemowlę ma zostać wypisane ze żłobka (48-72 godziny życia). Charakterystykę pacjentek, w tym wiek ciążowy, masę urodzeniową, płeć i punktację w skali Apgar w 1' i 5' po urodzeniu, podsumowano w specjalnym formularzu opisu przypadku.

Od każdego niemowlęcia pobiera się po dwie próbki kału podczas wizyt kontrolnych w 7. i 30. dniu życia. Podczas każdej wizyty informacje dotyczące przyrostu masy ciała, stanu klinicznego, żywienia i trwającego leczenia (tj. stosowanie prebiotyków, probiotyków, antybiotyków) pobierane są od rodziców niemowląt.

Po pobraniu próbki kału umieszcza się w ponumerowanych, zakręcanych, sterylnych plastikowych pojemnikach i natychmiast zamraża w temperaturze -80°C, aż zostaną przetworzone w celu ekstrakcji bakteryjnego DNA.

Analizy mikrobiologiczne są wykonywane na Wydziale Nauk Rolniczych Uniwersytetu Bolońskiego. Badacze przeprowadzający analizy są ślepi na tożsamość grupową niemowląt (IAP lub grupa kontrolna).

Dwieście miligramów kału wykorzystuje się do ekstrakcji bakteryjnego DNA przy użyciu zestawu QIAamp DNA Stool Mini Kit (QIAGEN, West Sussex, Wielka Brytania). Wyekstrahowany DNA przechowuje się w temperaturze -80°C. Czystość i stężenie wyekstrahowanego DNA określa się mierząc stosunek absorbancji przy 260 i 280 nm (Infinite® 200 PRO NanoQuant, Tecan, Mannedorf, Szwajcaria).

Oznaczenie ilościowe wybranych grup drobnoustrojów (Lactobacillus spp., Bifidobacterium spp., Bacteroides fragilis) przeprowadza się metodą PCR w czasie rzeczywistym. Dane uzyskane z amplifikacji przekształca się w celu uzyskania liczby komórek bakteryjnych na gram kału, wyrażonej jako log jednostek tworzących kolonie (CFU)/g.

Uzyskane dane są analizowane przy użyciu IBM SPSS Statistic wersja 20.0.0 (IBM Corporation, IBM Corporation Armonk, Nowy Jork, Stany Zjednoczone). Charakterystykę wyjściową w grupach IAP i kontrolnych porównuje się za pomocą testu U Manna-Whitneya dla prób niezależnych dla zmiennych ciągłych i testu chi-kwadrat dla zmiennych kategorycznych. Wpływ IAP na liczbę bakterii w kale w 7 i 30 dniu życia ocenia się za pomocą testu U Manna-Whitneya dla niezależnych próbek. Hierarchiczna analiza regresji wielokrotnej jest przeprowadzana w celu oszacowania wpływu IAP na liczbę bakterii w kale po uwzględnieniu rodzaju karmienia niemowląt (kodowane jako binarna zmienna kategoryczna: wyłączne karmienie piersią vs. karmienie dowolnym mlekiem modyfikowanym). Wartość p