Mezenchymalne komórki macierzyste do kserostomii wywołanej promieniowaniem (MESRIX)

Projekt Randomizowana, kontrolowana próba z zaślepieniem. Aby zachować ukrywanie przydziału, wszyscy uczestnicy, opiekunowie, badacze badania i osoby oceniające wyniki, z wyjątkiem personelu Banku Krwi, nie będą świadomi interwencji. Personel Banku Krwi nie będzie miał bezpośredniego kontaktu z pacjentami (dalej uczestnikami).

Plan projektu W celu włączenia do badania uczestnicy będą mieli zebraną historię medyczną zgodnie z wytycznymi Oddziału Chirurgii Ucha, Nosa i Gardła Kopenhaskiego Szpitala Uniwersyteckiego Rigshospitalet.

Wszyscy uczestnicy przejdą mini odsysanie warg, z którego MSC zostaną namnożone ex vivo w pomieszczeniu czystym zatwierdzonym przez dobrą praktykę produkcyjną (GMP) (The Blood Bank, sekcja 2014). Kiedy komórki dotrą do Banku Krwi, uczestnicy zostaną losowo przydzieleni do ekspansji ex vivo ich mezenchymalnych komórek macierzystych lub do zamrożenia ich do potencjalnego późniejszego wykorzystania. Przewidywana faza ekspansji ex vivo to 3-4 tygodnie. Oczyszczanie i izolacja będą oparte na protokole uprzednio zatwierdzonym do użytku klinicznego.

Ilość MSC wymagana do wstrzyknięcia Na podstawie opublikowanych badań na zwierzętach ilość podana myszom w celu usunięcia kserostomii waha się od 2 x 105 do 2 x 106 [19]. Aby przeliczyć te dane myszy na realistyczną dawkę dla ludzi, przeprowadziliśmy ekstrapolację w oparciu o następujące dane: Gęstość objętościowa gruczołów podżuchwowych jest bardzo zbliżona do 1 (1,06-1,07 mg/mm3) [27]. W badaniach nad radioterapią na myszach średnia masa gruczołu wynosiła około 350 mg, co odpowiada przybliżonej objętości 350 mm3. Dlatego dawka myszy pr. objętość gruczołu wynosi około 286 000-2 860 000 komórek pr. cm3 dławika (przy obliczaniu od 1 x 105 do 1 x 106). Objętość ślinianki podżuchwowej u ludzi po radioterapii wynosi 6,6-7,9 cm3 [28]. Odpowiada to przybliżonej dawce pr. pacjent o wymiarach od 1,9 x 106 do 2,2 x 106 lub od 1,9 x 107 do 2,2 x 107 komórek pr. ślinianka podżuchwowa. Z powyższych założeń i aby nie dać zbyt wielu komórkom wybraliśmy dawkę maksymalną odpowiadającą 2,8*10^6 MSC/cm^3 gruczołu, czyli maksymalną dawkę całkowitą na pacjenta wynoszącą około 4,6*10 ^ 7 MSC. Jednak w celu ujednolicenia dawki podawanej pacjentom, podawana ilość będzie dostosowana do wielkości ich gruczołów podżuchwowych, jak opisano poniżej.

Wstrzyknięcie MSC do gruczołów podżuchwowych Pacjenci będą kierowani do oddziału laryngologicznego, sekcja 2073 w celu przeprowadzenia zabiegów szpitalnych. Zabieg chirurgiczny wykonywany jest w znieczuleniu miejscowym pod kontrolą ultradźwięków iw sterylnej technice. Po otrzymaniu zawiesiny MSC lub zawiesiny placebo chirurg zidentyfikuje gruczoły podżuchwowe i wstrzyknie zawiesinę MSC. Obliczenie liczby wstrzykniętych MSC pr. uczestnik opiera się na następującym wyliczeniu: , gdzie objętość to objętość ślinianki podżuchwowej, a gruczoł-objętość ok. 7-8cm3 to norma. Dlatego ilość komórek rozdanych każdemu uczestnikowi wyniesie ok. w sumie. Następnie uczestnik otrzyma opatrunek i dostępne bez recepty środki przeciwbólowe. MSC zostaną zawieszone w izotonicznym NaCl (0,9 mg/ml) i 1% albuminie ludzkiej (HA) do końcowej objętości 2 ml. Placebo to 2 ml izotonicznego NaCl (0,9 mg/ml) i 1% HA.

Kontrolne MRI miejsca biorczego zostanie wykonane po 3-4 tygodniach i 3-4 miesiącach po operacji. MRI służy do określania objętości gruczołów ślinowych i kontroli miejsca biorczego.

Po 3-4 miesiącach pobiera się losowo małą biopsję z jednego z dwóch gruczołów ślinowych. Zabieg odbywa się w znieczuleniu miejscowym. Określa się histologię (próbki są zaślepione dla patologa).

Po wykonaniu końcowego rezonansu magnetycznego, biopsji i badaniu funkcji śliny ok. 3-4 miesiące po leczeniu zakończono testy i działania związane z określonymi badaniami. W celu wykrycia późnych powikłań lub późnych zdarzeń niepożądanych wszyscy uczestnicy badania, którzy otrzymali leczenie MSC, są zapraszani na kontrolę po 1 roku i 3 latach od leczenia.

Bezpieczeństwo, izolacja i rozmnażanie MSC Bank Krwi posiada aprobatę na tkankę komórkową wydaną przez Duński Urząd ds. Zdrowia i Leków (zgodnie z duńską ustawą o tkankach), a także Autoryzację Producenta/Importera dotyczącą Produktów Leczniczych dla Ludzi, niezbędne zaplecze fizyczne, personel i zasoby operacyjne do produkcji MSC zgodnie z dobrą praktyką wytwarzania (GMP).

Produkt MSC zostanie przetestowany pod kątem uznanych markerów powierzchniowych (CD73, CD90, CD105,) za pomocą cytometrii przepływowej i przejdzie ogólne kontrole jakości przed ostatecznym wydaniem (żywotność komórek i testy na mikroorganizmy). Jeśli chodzi o hodowlę MSC, będziemy używać podłoża podstawowego uzupełnionego lizatem ludzkich płytek krwi od zdrowych dawców krwi zamiast dotychczas stosowanej surowicy pochodzenia zwierzęcego (fetal bydlęca surowica, FBS). Ma to następujące zalety: 1) Brak prawdopodobieństwa transfekcji zarówno znanych, jak i nieznanych patogenów zwierzęcych lub ryzyka ksenoimmunizacji 2) Niewielka zmienność między partiami, a tym samym bardziej spójny wzrost, ponieważ każda grupa jest przygotowywana z ok. 50 zdrowych dawców.

Wszystkie zbiory, izolacja, ekspansja itp. MSC będą zgodne z przepisami GMP. Bank Krwi dysponuje pomieszczeniami czystymi zatwierdzonymi przez Duński Urząd ds. Zdrowia i Leków do ekspansji komórek zgodnej z GMP do użytku klinicznego, a wszystkie badania będą przeprowadzane przez specjalnie przeszkolony personel.

Ocena kserostomii i subiektywny wynik leczenia Subiektywny efekt leczenia ocenia się za pomocą 100-milimetrowej wizualnej analogowej skali kserostomii wypełnianej przez pacjenta [31] oraz kwestionariusza ocenianego przez lekarza [32], zarówno przed, jak i po zabiegu leczenie. Każdy uczestnik zostanie również zapytany o codzienne objawy suchości w jamie ustnej zgodnie ze skalą oceny skutków ubocznych UKU poz. 3.3 [29]. Skala ta zawiera cztery wyniki, gdzie 0 oznacza brak uczucia suchości w ustach, 1 oznacza lekkie uczucie suchości w ustach, 2 oznacza silne uczucie suchości w ustach, a 3 oznacza dokuczliwe uczucie suchości w ustach, które utrudnia mówienie i jedzenie.

Ocena szybkości wydzielania śliny i obiektywnych wyników leczenia Zmiany szybkości wydzielania niestymulowanej śliny pełnej w jamie ustnej są prawdopodobnie najważniejszym parametrem rozwoju biologicznego kserostomii i towarzyszących jej patologii jamy ustnej. W jamie ustnej miesza się cała ślina, np. zmieszane wydzieliny z większych i mniejszych gruczołów ślinowych. Prawidłowe określenie tej wartości jest kluczowe dla oceny wyniku leczenia w tym projekcie. Do oceny szybkości wydzielania śliny pobierana będzie ślina pełna w godzinach 9-12. Pacjenci powstrzymują się od jedzenia, picia, palenia i higieny jamy ustnej przez 2 godziny przed pobraniem. Po usadzeniu w pozycji pionowej na krześle, odpoczywają przez 5 minut, a następnie są instruowani, aby podczas pobierania wykonywać jak najmniej ruchów, w tym połykania.

Przed i po zabiegu zostanie pobrana niestymulowana ślina pełna metodą plucia [33], w której uczestnicy wypluwają swoją ślinę do pojemnika zbiorczego przez okres 15 minut. Szybkość wydzielania śliny (SFR) (ml/min) określa się jako przyrost masy pojemnika podzielony przez czas pobierania w minutach.

Po pobraniu niestymulowanej śliny badanym poleca się żucie 1 g sterylnej parafiny. Zostaną poproszeni o trzymanie ust zamkniętych podczas żucia i unikanie połykania. Co 60 sekund będą proszeni o plucie do nowego ślinociągu przed rozpoczęciem nowego okresu żucia. Będzie to powtarzane przez 5 minut.

W celu oceny wyników leczenia ślinianek podżuchwowych pobiera się również ślinę bezpośrednio z dna jamy ustnej w stanie niestymulowanym i stymulowanym. Niestymulowaną szybkość wypływu całej śliny ze ślinianek podżuchwowych ocenia się metodą wymazową za pomocą wacików umieszczonych policzkowo w każdym rejonie trzonowców szczęki i pod językiem na dnie jamy ustnej. Bezpośrednio przed rozpoczęciem pobierania zostaną poproszeni o połknięcie śliny, jeśli nie będzie to możliwe, ślina zostanie pobrana za pomocą pipety. Zbieranie odbywa się w dwóch kolejnych 3-minutowych okresach, a pod koniec każdego okresu podbródek i usta zostaną wytarte serwetką. Natężenia przepływu śliny określa się wagowo (1 g równa się 1 ml śliny) przy użyciu rolek i serwetek ważonych przed pobraniem i ponownie ważonych po. Natężenia przepływu oblicza się jako przyrost masy podczas zbierania i wyraża w mililitrach na minutę. Ślina z rolek bawełny zostanie wyekstrahowana przez odwirowanie (1500 g) i przeanalizowana pod kątem jej składu. Ten stymulowany proces pobierania zostanie następnie przeprowadzony za pomocą rolek zawierających cytrusy, aby maksymalnie stymulować gruczoły podżuchwowe. Z każdej z tych kolekcji śliny, ślina zostanie podzielona na porcje i przechowywana w -80°C.

Analiza chemiczna śliny Ślina pełna zawiera dużą liczbę bakterii i komórek nabłonka, a także płyn dziąsłowy. Dlatego cała ślina zwykle nie nadaje się do analizy wrażliwych parametrów chemicznych. W tym celu znacznie lepiej sprawdza się selektywnie pobierana ślina z poszczególnych gruczołów. W rezultacie większość analiz można wykonać zarówno ze ślinianki przyusznej, jak i ślinianki podżuchwowej / śliny podjęzykowej. W pobranej ślinie zostaną wykonane analizy: pH i wodorowęglanów poprzez oznaczenie równowagi jonowej [34], sodu, potasu, wapnia, fosforanów, chlorków i fluorków [35], białka całkowitego i wybranych białek [36] oraz amylazy [37]. . Celem badań jest ocena, czy po leczeniu ślina ulegnie normalizacji, a tym samym oszacowanie zdolności śliny do ochrony zębów i błon śluzowych przed i po leczeniu.

Gromadzenie i analiza danych Dane źródłowe: Dokumentacja źródłowa dla wszystkich danych będzie zawarta w formularzu opisu przypadku (CRF).

Kierownik badania umożliwia bezpośredni dostęp do danych z badań i dokumentów z badań w celu monitorowania, audytu i inspekcji Komisji Etyki Naukowej, Duńskiego Urzędu ds. Zdrowia i Leków lub podobnych organów w innych krajach. Na przetwarzanie danych osobowych zgodnie z duńską ustawą o ochronie danych wymagane będzie uzyskanie zgody organu ochrony danych. Wnioski będą przesyłane za pośrednictwem sekretariatu prawnego Rigshospitalet.