Leczenie uzupełniające u pacjentów w podeszłym wieku z zapaleniem przyzębia poprzez podawanie suplementu bogatego w oleuropeinę z liścia oliwnego (OLIVAGING)

Aby obliczyć wielkość próby, narzędzie GRANMO (https://www.imim.es/ofertadeserveis/software-public/granmo/) zastosowano, biorąc pod uwagę ryzyko alfa 0,05, dwustronny kontrast, ryzyko beta 0,20, odchylenie standardowe różnic 2,5, minimalną różnicę 1 mm zmniejszenia głębokości sondowania, która ma zostać wykryta między punktem wyjściowym a końcem badania, oraz przewidywana część utraty 20% śledzenia.

Leczenie Wszyscy pacjenci zostaną poddani kompletnemu badaniu jamy ustnej na początku leczenia i po 4 miesiącach od zakończenia leczenia. Terapia wstępna zostanie przeprowadzona u wszystkich pacjentów i będzie polegała na wykonaniu skalingu całej jamy ustnej i wyrzeźbieniu korzenia, ręcznie iw razie potrzeby przy użyciu narzędzi ultradźwiękowych. Zabieg ten zostanie zakończony instruktażem higieny jamy ustnej. Wszystkie zabiegi terapii wstępnej będą wykonywane przez tego samego lekarza periodontologa.

Po leczeniu periodontologicznym, zapisani ochotnicy zostaną losowo przydzieleni do jednej z dwóch grup przez drugiego periodontologa. Grupa kontrolna otrzyma twarde kapsułki żelatynowe zawierające placebo (tylko substancje pomocnicze), podczas gdy grupa eksperymentalna otrzyma te same twarde kapsułki żelatynowe, ale zawierające 200 mg ekstraktu z liści oliwnych. Randomizacja zostanie przeprowadzona za pomocą losowych wykresów liczbowych (w formie rzutu monetą), które zostaną przeprowadzone w momencie zapisania pierwszego podmiotu, a kolejny podmiot zostanie przydzielony do drugiej grupy na podstawie przypisania pierwszego podmiotu. Zarówno placebo, jak i kapsułki będą wydawane przez tę samą osobę, a badani otrzymają ustne i pisemne instrukcje dotyczące ich stosowania. W miarę jak ochotnicy będą zapisywani, zostaną im przydzielone kolejne numery badań i zaopatrzeni w kapsuły, które wystarczą na jeden miesiąc. W trakcie trwania próby badani będą przychodzić na Wydział co 4 tygodnie w celu uzupełnienia kapsułek. Przyjmowanie kapsułek wystarczy na łącznie 4 miesiące. Pozostałe leki zostaną sprawdzone pod kątem zgodności. Kapsułki będą przygotowywane w CIDAF (Centro de Investigación Sobre Alimentos Funcionales) w Technologicznym Parku Zdrowia w Granadzie. Ekstrakt z oliwek będzie pozyskiwany od firmy Natac (Madryt, Hiszpania).

Pobieranie próbek i analizy Wszystkie dane zbierane i oznaczane będą wykonywane na początku badania i po 4 miesiącach.

A) Badania jamy ustnej Kliniczne pomiary periodontologiczne obejmują obecność lub brak płytki nazębnej naddziąsłowej i krwawienia z dziąseł podczas sondowania (BOP), jak również głębokość sondowania przyzębia (PPD) i recesję brzegu dziąsła (GM). Parametry będą mierzone w sześciu miejscach (przyśrodkowo-policzkowo, policzkowo, podpoliczkowo, podjęzykowo, językowo i mezjalno-językowo) na każdym zębie za pomocą skalibrowanej sondy periodontologicznej (Hu-Friedy®, Chicago, IL, USA), o długości 15 mm i 0,35 mm średnicy. Kliniczny poziom przywiązania (CAL) zostanie obliczony poprzez dodanie recesji do PDD. Liczba pozostałych zębów również zostanie zarejestrowana. Obliczony zostanie również wskaźnik blaszki miażdżycowej O´Leary'ego, wskaźnik krwawienia Van der Veldena. Pacjenci z miejscem BOP <10%, PPD ≤3 mm, bez rumienia i obrzęku będą uważani za osoby zdrowe pod względem przyzębia.

B) Gromadzenie danych socjodemograficznych

1. Podstawowe dane socjodemograficzne: będą to wiek, płeć, lata nauki.
2. Status finansowy: uczestnicy zostaną poproszeni o podanie średniego dochodu z ostatnich trzech lat na czterostopniowej skali (niski, niewystarczający do pokrycia codziennych wydatków = 1, średni, starający się pokryć codzienne wydatki = 2, dobry, wystarczający do pokrycia codziennych wydatków wydatki dzienne = 3, bardzo dobrze, bardzo dobrze na pokrycie wydatków dziennych = 4).
3. Status palenia: obecni palacze zostaną zdefiniowani jako palacze w czasie wywiadu. Byli palacze zostaną zdefiniowani jako osoby, które wcześniej paliły, ale nie paliły przez rok lub dłużej. Pozostali uczestnicy zostaną określeni jako okazjonalni lub nieaktualni palacze.
4. Poziom aktywności fizycznej: będzie oceniany w minutach ekwiwalentu metabolicznego (MET) tygodniowo, przy użyciu Międzynarodowego Kwestionariusza Aktywności Fizycznej (IPAQ). Ci, którzy zgłoszą co najmniej 3 minuty MET tygodniowo, zostaną sklasyfikowani jako aktywni fizycznie (minimalnie aktywni - lub „aktywna aktywność fizyczna poprawiająca zdrowie (HEPA)”). Wszyscy pozostali zostaną określeni jako nieaktywni fizycznie. Ponadto rejestrowana będzie tygodniowa częstotliwość aktywności fizycznej.
5. Objawy depresji z ostatniego miesiąca: zostaną ocenione za pomocą zatwierdzonej skróconej, samoopisowej Geriatrycznej Skali Depresji (GDS) (zakres 0-20). Wynik GDS między 0 a 4 zostanie użyty do wskazania braku depresji, podczas gdy wyniki 5-10 i N 10 wskażą odpowiednio łagodną i ciężką depresję.
6. Korzystanie z opieki zdrowotnej: rejestrowana będzie obecność prywatnych gabinetów lekarskich, publicznych lub niepublicznych ośrodków opieki zdrowotnej lub szpitali w obszarze zamieszkania, a także roczna liczba wizyt w celu regularnej kontroli stanu zdrowia.
7. Partycypacja społeczna dorosłych: w tym celu rejestrowana będzie tygodniowa częstotliwość ich zajęć towarzyskich z rodziną, przyjaciółmi oraz roczna częstotliwość wycieczek.

C) Cechy antropometryczne i ciśnienie krwi

1. Zmierzona zostanie waga, wzrost i obwód talii. Obliczone zostanie BMI i stosunek talii do bioder. Nadwaga będzie zdefiniowana jako BMI pomiędzy 25,0 a 29,9 kg/m2, natomiast otyłość jako BMI >29,9 kg/m2.
2. Ciśnienie krwi: pacjenci z ciśnieniem krwi >140/90 mmHg lub stosujący leki hipotensyjne zostaną sklasyfikowani jako chorzy na nadciśnienie.

D) Ocena nawyków żywieniowych Ocena nawyków żywieniowych będzie oparta na półilościowym kwestionariuszu częstości spożywania posiłków (FFQ). Do oceny stopnia przestrzegania diety śródziemnomorskiej posłuży FFQ, wykorzystano MedDietScore (teoretyczny zakres 0-55).

E) Pobieranie i analiza krwi Próbki krwi (16 ml) będą pobierane przez nakłucie żyły przedramienia po 12 godzinach całonocnego postu, bez zastoju w pozycji siedzącej. Próbki krwi pełnej zostaną użyte do oceny hematologicznej. Większość krwi zostanie pobrana do probówek zawierających EDTA (1 mg/ml), a osocze zostanie wyizolowane przez odwirowanie przy 1000 xg przez 10 min i podzielone na porcje po 250 μl do natychmiastowej analizy lub do przechowywania w -80 °C . Krew zostanie również wykorzystana do uzyskania izolowanych komórek jednojądrzastych krwi (BMC) do innych dodatkowych analiz. Porcje zawierające zarówno osocze, jak i BMC będą przechowywane w temperaturze -80°C do czasu analizy.

Analizy krwi będą następujące:

1. Oceny biochemiczne: poziom lipidów we krwi na czczo (w tym cholesterol lipoprotein o dużej gęstości (HDL), cholesterol lipoprotein o małej gęstości (LDL), cholesterol bezpośredni LDL, cholesterol o bardzo małej gęstości (VLDL) i triglicerydy (TG), stężenie glukozy w osoczu , za pomocą automatycznego analizatora w osoczu zostaną oznaczone wysokoczułe poziomy białka C-reaktywnego, LPa, kortyzolu, fibrynogenu i homocysteiny. Pacjenci wykazujący stężenie glukozy we krwi na czczo > 126 mg/dl, stosujący leki przeciwcukrzycowe lub z wcześniejszą diagnozą cukrzycy zostaną uznani za cukrzycę typu 2 zgodnie z kryteriami diagnostycznymi American Diabetes Association. Hipercholesterolemia zostanie zdefiniowana jako całkowity poziom cholesterolu w surowicy >200 mg/dl lub stosowanie środków obniżających poziom lipidów, zgodnie z wytycznymi panelu III National Cholesterol Education Program Adult Treatment Panel.
2. Badanie hematologiczne: hemogram i profil krwinek w próbkach krwi pełnej.
3. Krążące markery prozapalne: poziomy krążących wielu cytokin zapalnych, w tym IL-1β i IL-18, będą analizowane za pomocą komercyjnego zestawu multipleksowego (Cytokine Panel 1B 25plex, Thermo Fisher Scientific). Ponadto poziomy białka aktywnej kaspazy-1 i ekspresja genów Nlrp3 (CIAS1) i kaspazy-1 zostaną określone w izolowanych PBMC, odpowiednio, metodą Western-Blotting i RT-PCR, w celu oceny aktywności inflammasomu.
4. Markery autofagii: poziomy MAP-LC3, ATG12, p62, TFEB, Beclin-1 oraz katepsyn B i D zostaną określone metodą Western-Blotting w izolowanych izolatach białek PBMC. Ekspresje genów Beclin-1, y Maplc3 zostaną określone za pomocą RT-PCR w wyizolowanych PBMC przy użyciu beta-aktyny jako genu gospodarza.
5. Markery stresu oksydacyjnego i zdolność antyoksydacyjna: uszkodzenie lipidów będzie analizowane poprzez oznaczenie w moczu izoprostanu 15-F2, uszkodzenie białek poprzez oznaczenie białek karbonylowych w osoczu68 oraz uszkodzenie DNA poprzez oznaczenie w moczu 8-hydroksyguanozyny (8OHdG) . Dodatkowo w klinice zostanie przeprowadzone u badanych badanie stanu redoks in situ z wykorzystaniem kropli krwi z palca. Zostanie przeprowadzone za pomocą systemu Redoxsys (Aytu BioScience, Inc., Englewood, USA), który mierzy również zdolność antyoksydacyjną próbki. Jest to nowy system, który mierzy z wiarygodnością, zanim nie był dostępny, całkowity ładunek redoks w próbkach biologicznych, jak również ich zdolność przeciwutleniającą.
6. Badanie metabolomiczne: aby przeprowadzić tę analizę, najpierw ekstrahuje się metabolity z różnych próbek. Następnie cząsteczki obecne w ekstrakcie metanolowym rozdziela się metodą chromatografii. Eluat jest monitorowany w systemie ESI-Q-TOF-MS/MS za pomocą elektrorozpylania98. Analiza wyników zostanie przeprowadzona we współpracy z dr Reinaldem Pamplona z University of Lleida, z którym współpracujemy w tej kwestii od lat iz którym dzielimy linię badań i publikacji z zakresu metabolomiki.

F) Badanie mikroflory przyzębia. Próbki płytki nazębnej poddziąsłowej zostaną pobrane z trzech miejsc o najwyższych PPD poprzez przyłożenie do kieszonki przyzębnej czubka bibuły filtracyjnej w ciągu 30 s po wyizolowaniu strefy.

Próbki płytki poddziąsłowej pobrane na suche bibuły zostaną poddane analizie PCR w celu oceny obecności znanych peridontopatogenów: Phorphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia, Treponema denticola, Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Prevotella intermedia, Fusobacterium nucleatum. Badania mikrobiomu zostaną przeprowadzone przy użyciu technik sekwencjonowania masowego 16S rDNA. Sekwencjonowanie i analiza bioinformatyczna zostaną przeprowadzone przez Integrated Microbiome Resource z University of Dalhousie w Kanadzie.

G) Oznaczenia w moczu.

Zostanie pobrany mocz na czczo i wykonane zostaną następujące oznaczenia:

1. Markery uszkodzeń oksydacyjnych: 8-hydroksy-2-deoksyguanozyna i całkowite F2-izoprostany zostaną zmierzone w moczu za pomocą konkurencyjnego testu immunologicznego. Wyniki zostaną znormalizowane do kreatyniny w moczu.
2. Stężenie metabolitów oleuropeiny: zostaną one określone ilościowo za pomocą LC-ESI-MS/MS, tak jak w poprzednich badaniach.

H) Rachunek wskaźnika pomyślnego starzenia się Wskaźnik pomyślnego starzenia się (SAI), z potencjalnymi wynikami w zakresie od 0 do 10, zostanie wykorzystany do oceny starzenia się uczestników badania. Pełny indeks obejmuje wykształcenie, status finansowy, aktywność fizyczną, BMI, wynik GDS, udział w zajęciach towarzyskich z przyjaciółmi, rodziną, coroczne wycieczki, punktację czynników ryzyka CVD i stopień przestrzegania diety śródziemnomorskiej w celu opracowania indeksu. Opracowana zostanie zmienna skumulowana (zakres 0-4) wskazująca ogólne obciążenie klasycznymi czynnikami ryzyka chorób sercowo-naczyniowych (tj. jeden czynnik 1 itd.).

I) Kryteria powodzenia interwencji Aby ocenić powodzenie interwencji z użyciem oleuropeiny, jako główną zmienną przyjęto zmniejszenie głębokości sondowania (PD) o 1 mm lub więcej. Dodatkowo, jako drugorzędne kryterium sukcesu, zostanie przyjęte zmniejszenie poziomu przyczepu o 1 mm lub więcej, jak również zmniejszenie o ponad 20% krwawienia dziąseł podczas sondowania.

J) Analiza statystyczna Zostanie przeprowadzona analiza opisowa głównych badanych zmiennych. Dla normalnych zmiennych ilościowych obliczona zostanie średnia i odchylenie standardowe lub mediana i percentyle w przypadku braku normalności. Zmienne jakościowe zostaną wyrażone przy użyciu częstości bezwzględnych i względnych. Normalność zmiennych zostanie sprawdzona testem Kołmogorowa-Smirnowa w celu określenia konieczności przeprowadzenia przekształceń (logarytmicznych i innych) przed przeprowadzeniem badań porównawczych. Aby zbadać wpływ leczenia na różne zmienne w tej samej grupie, zostanie zastosowany test t-Studenta dla powiązanych próbek. W celu przeprowadzenia analiz porównawczych w tym samym czasie doświadczalnym pomiędzy obiema grupami doświadczalnymi zostanie wykorzystany test t-Studenta dla prób niezależnych.