Badanie weryfikacyjne i walidacyjne szybkiego testu diagnostycznego na antygen Leishmania

Leiszmanioza trzewna (VL) lub kala azar jest zaniedbaną chorobą tropikalną (NTD) wywoływaną przez pierwotniaki pasożytnicze z kompleksu Leishmania donovani przenoszone przez muszki flebotomiczne. Szacuje się, że rocznie na całym świecie odnotowuje się od 50 000 do 90 000 nowych przypadków. Charakteryzuje się gorączką, utratą masy ciała, powiększeniem śledziony i wątroby oraz niedokrwistością, a bez leczenia może zakończyć się śmiercią w ponad 95% przypadków. W Rogu Afryki występuje największa liczba przypadków VL na świecie, a społeczności żyjące w odległych miejscach o ograniczonych zasobach są najbardziej narażone na infekcję. Dlatego wczesna i dokładna diagnostyka VL w placówkach służby zdrowia jest niezbędna. VL jest śmiertelny, jeśli nie jest odpowiednio leczony. Leki stosowane obecnie w leczeniu VL mogą powodować poważne skutki uboczne, a obraz kliniczny VL nie jest wystarczająco specyficzny, aby decydować o leczeniu. Dlatego też bardzo dokładne (zarówno czułe, jak i swoiste), tanie i proste szybkie testy diagnostyczne (RDT) mają kluczowe znaczenie w leczeniu przypadków VL. Wczesne wykrycie przypadku, a następnie odpowiednie leczenie ma również kluczowe znaczenie dla kontroli VL.

W Kenii leiszmaniozę trzewną diagnozuje się za pomocą rK39 RDT na podstawie wykrycia przeciwciał gospodarza przeciwko rekombinowanemu antygenowi leiszmanialnemu o długości 39 aminokwasów w przypadkach z klinicznym podejrzeniem. Ponieważ test ten ma suboptymalną czułość wynoszącą około 85%, często konieczne są inne dodatkowe badania diagnostyczne. Należą do nich test bezpośredniej aglutynacji (DAT) oparty na aglutynacji całego antygenu pasożyta przez specyficzne dla pasożyta przeciwciała żywiciela oraz mikroskopowe wykrywanie amastigotów w barwionych rozmazach z nakłuć węzłów chłonnych, aspiratach szpiku kostnego lub śledziony, które są obecnie złotym standardem w diagnostyce potwierdzającej.

Chociaż stosowanie rK39 RDT i DAT wzrasta, testy te nie pozwalają na odróżnienie infekcji aktywnych od przeszłych, ponieważ opierają się na wykryciu przeciwciał przeciw leiszmanii, które są obecne zarówno w aktywnych, jak i przebytych infekcjach. Co więcej, DAT wymaga pewnych umiejętności laboratoryjnych i całonocnych inkubacji przed uzyskaniem wyników, a rK39 ma niską czułość, gdy jest stosowany w Afryce Wschodniej. W związku z tym podjęto wysiłki w celu opracowania testu opartego na wykrywaniu antygenu, który opiera się na pobieraniu minimalnie inwazyjnych próbek, takich jak krew lub mocz.

W tym celu współpraca pomiędzy firmami KEMRI, DNDi, FIND i Uniwersytetem w Yorku w ramach projektu EDCTP „Diagnostyka nowej generacji i leczenie doustne leiszmaniozy trzewnej w Afryce Wschodniej: transformacja opieki nad pacjentem poprzez innowacje” (VL-INNO) ma na celu opracowanie antygenu test diagnostyczny oparty na biomarkerach pasożytów w moczu i krwi pacjentów z VL. W tym projekcie podejście proteomiczne zostanie wykorzystane do identyfikacji potencjalnych antygenów Leishmania występujących we krwi i moczu potwierdzonej leiszmaniozy trzewnej. Uniwersytet w Yorku przeprowadzi analizy proteomiczne próbek przy użyciu bardzo czułego spektrometru masowego z potrójnym kwadrupolowym chromatografem cieczowym (LCMS/MS) w celu zbadania różnorodności antygenów w określonych zarchiwizowanych próbkach klinicznych (krew, mocz) od pacjentów z VL przed i po leczeniu. W oparciu o wydajność, stabilność i immunogenność antygenów, zostaną wytworzone przeciwciała monoklonalne (mAb) na potrzeby późniejszego opracowania prototypu szybkiego testu diagnostycznego z przepływem bocznym (RDT), który będzie w stanie wykryć antygeny leiszmanii we krwi i/lub moczu pacjentów z VL.

Ponieważ działania te zostały zainicjowane przy użyciu próbek pobranych wcześniej od pacjentów z VL w Kenii, niniejszy protokół ma na celu pobranie próbek (krew i moczu) z dwóch ośrodków leczenia VL, mianowicie szpitala podokręgowego Chemolingot w hrabstwie Baringo i hrabstwa Kacheliba w hrabstwie West Pokot, w celu można wykorzystać w ocenie prototypu RDT. Przeanalizujemy próbki od pacjentów z VL pobrane przed i po zakończeniu leczenia, aby określić czułość testu i wpływ zmian w ilości antygenów pasożyta w moczu i krwi w wyniku wyleczenia klinicznego. Próbki od zdrowych endemicznych kontroli zostaną wykorzystane do określenia specyficzności testu.