Wolne hydroksylo wolne rodniki związane z działaniem inhibitorów SGLT-2 w cukrzycy typu 2

Dystalna symetryczna polineuropatia (DSPN) jest jednym z najczęstszych powikłań mikronaczyniowych cukrzycy typu 2 (T2D), dotykającym około 50% pacjentów w trakcie ich choroby. To złożone zaburzenie obejmuje zarówno zniewagi metaboliczne, jak i naczyniowe prowadzące do uszkodzenia włókien nerwowych przy użyciu stresu oksydacyjnego napędzanego hiperglikemią, zmniejszonym przepływem krwi nerwowej i przewlekłego subklinicznego zapalenia przyczyniającego się do jego patogenezy.

Obecność DSPN zaburza jakość życia i jest również związana ze zwiększoną śmiertelnością.

Pomimo osiągnięcia optymalnej kontroli glikemii, neuropatia cukrzycowa często postępuje z powodu wpływów wieloczynnikowych, w tym przewlekłego stresu oksydacyjnego i uszkodzenia mikronaczyniowego. Tradycyjne terapie koncentrowały się na objawowej uldze, takim jak leczenie bólu z lekami przeciwdrgawkowymi lub leki przeciwdepresyjne, oraz na próbach powolnego postępu choroby poprzez ukierunkowanie na hiperglikemię. W związku z tym nowe interwencje dotyczące dodatkowych czynników patogennych, w tym stresu oksydacyjnego, mogą zapewnić lepsze wyniki kliniczne w DSPN. W etiologii neuropatii cukrzycowej stres oksydacyjny odgrywa znaczącą rolę.

W warunkach fizjologicznych fenyloalanina jest hydroksylowana enzymatycznie w pozycji para, wytwarzając para-tyrozynę. Jednak w warunkach zwiększonego stresu oksydacyjnego, na przykład podczas ataku rodnika hydroksylowego (• OH), fenyloalanina może być błędnie hydroksylowana w pozycjach Ortho i Meta, powodując powstanie orto-tyrozyny (O-Tyr) i meta-tyrozyny (M. -Tyr). Te atypowe izomery tyrozynowe są zazwyczaj nieistotne w zdrowych stanach; Zatem ich podwyższone poziomy lub zwiększone nieprawidłowe stosunki służą jako wrażliwe biomarkery uszkodzeń oksydacyjnych za pośrednictwem rodników hydroksylowych, co może być szczególnie istotne w chorobach przewlekłych związanych z trwałym stresem oksydacyjnym. Biorąc pod uwagę te szlaki stresu oksydacyjnego, kwas alfa-lipoinowy (ALA) został zbadany jako terapia przeciwutleniająca, która przede wszystkim ukierunkowała produkcję wolnych rodników.

ALA została wykorzystana jako równoległe lub wspomagające podejście do istniejących strategii zarządzania glikemicznego, z krótkoterminowymi badaniami wykazującymi znaczną poprawę prędkości przewodzenia nerwu i objawów neuropatycznych. Jednocześnie terapia ALA jako ogólnoustrojowe leczenie przeciwutleniające, jednocześnie może mieć korzystny wpływ na twarde punkty końcowe sercowo -naczyniowe, jak wcześniej udowodniliśmy.

Podczas gdy terapia ALA podkreśla znaczenie walki z mechanizmami oksydacyjnymi, inhibitory Cotransporter-2 (SGLT-2) sodu (SGLT-2) są obecnie badane pod kątem potencjalnie szerszych działań ochronnych.

Inhibitory SGLT-2 wywierają główny wpływ na bliższy kanalik nerki poprzez blokowanie reabsorpcji glukozy i sodu, co powoduje niezależną od insuliny kontrolę glikemiczną poprzez zwiększone wydalanie glukozy w moczu. Proces ten indukuje łagodną osmotyczną diureę i natriureis, zmniejszając w ten sposób objętość krwi i prowadząc do klinicznie istotnego spadku ciśnienia krwi, zwykle w zakresie 2-5 mmHg. Dodatkowo wykazano, że inhibitory SGLT-2 łagodzą stres oksydacyjny i stan zapalny, tj. Mechanizmy, które mogą podkreślać obserwowane działanie sercowo-naczyniowe i nerkowe.

Eksperymenty na zwierzętach potwierdziły poprawę deficytów przewodzenia nerwów i zapobieganie utraty śródbuszowej błonnika nerwowego z hamowaniem SGLT-2 w modelach szczurów cukrzycowych, prawdopodobnie poprzez zmniejszoną zmienność glikemii, lepszą funkcję mikronaczyniową i modulację szlaków radykalnych hydroksylowych.

Duże próby sercowo-naczyniowe (np. EMPA-Reg, płótno, deklarowane) skupiały się przede wszystkim na punktach końcowych sercowo-naczyniowych, a nie wskaźnikach specyficznych dla neuropatii. W analizie post hoc wyniku EMPA-Reg. Zmiany samego hematokrytu oszacowano, że stanowią około 52% korzyści sercowo-naczyniowych empagliflozyna.

Chociaż inne główne próby inhibitora SGLT-2 (Declare-Timi 58, Canvas, Empa-Kidney) nie zapewniły podziału podobnego odsetka, każde z nich zgłosiły podwyżki hematokrytu, które mogą odzwierciedlać możliwy efekt podobny do erytropoetyny-efekt dodatkowo podkreślony w DAPA -CKD, gdzie uważano, że zwiększony hematokryt jest kluczowym czynnikiem w nefroprotekcyjnych korzyściach leku.

Z drugiej strony małe, mechanistyczne badanie okazało się tymczasowe podniesienie poziomu surowicy erytropoetyny przy użyciu kanagliflozyny, która była obecna tylko w pierwszych 4 tygodniach terapii SGLT-2, podczas gdy wzrost hematokrytu był przedłużony przez całe, 12 tygodni, 12 tygodni, 12 tygodni długi okres leczenia. Chociaż istnieją inne badania sugerujące dłuższy czas trwania podwyższenia erytropoetyny nawet przez 12 tygodni przez empagliflozynę, albo brak jej wzrostu po 24 tygodnia inhibitory.

Jednak do tej pory niewiele badań systematycznie oceniło krótkoterminowy neuroprotekcyjny wpływ inhibitorów SGLT-2 wraz ze zmianami markerów rodników hydroksylowych i parametrów RBC w jednej kohorcie.

W szczególności, kompleksowy systematyczny przegląd i metaanaliza przez Kandeela, obejmującą sześć badań na ludziach i łącznie 5312 pacjentów z cukrzycą, wykazały, że inhibitory SGLT-2 umiarkowanie poprawiły objawy neuropatii obwodowej cukrzycy, w tym poprawa prędkości przewodzenia zmysłów i nerwu ruchowego oraz potencjalna stabilizacja autonomiczna .

Na poparcie tych ustaleń Ishibashi i in. poinformował, że trzy lata terapii inhibitora SGLT-2 u pacjentów ze skromnie kontrolowaną cukrzycą typu 2 znacznie poprawiły wyniki neuropatii i spowolniony postęp nefropatii. Ponadto ostatnie perspektywy podkreślają, że wczesna interwencja i zajęcie się wieloma czynnikami metabolicznymi mogą ustabilizować, a nawet odwrotne uszkodzenie nerwu w DSPN, a krótkoterminowe dowody kliniczne pokazują, że empagliflozyna może poprawić parametry elektrofizjologiczne, zmniejszyć markery stresu oksydacyjnego oraz umiarkować objawy neuropatyczne w Neuropatycznym Pacjenci z cukrzycą.

Odkrycia te wskazują na mechanizmy wykraczające poza kontrolę glikemiczną, obejmującą tworzenie RBC, zmiany w metabolitach rodników hydroksylowych (takich jak orto-tyrozyna) oraz hemodynamika nerkowa.

Biorąc pod uwagę te zachęcające dane, przetestowaliśmy 4-tygodniową interwencję w celu uchwycenia natychmiastowych zmian rodników RBC i hydroksylowych, a także wczesnych zmian neuropatycznych.

Biorąc pod uwagę ograniczoną skuteczność istniejących metod leczenia, te potencjalne działanie ochronne są szczególnie istotne w kontekście złożoności neuropatii cukrzycowej, a poprzez bezpośrednio lub pośrednio zmniejszając stres oksydacyjny i wpływające na szlaki leżące u podstaw uszkodzenia nerwów, inhibitory SGLT-2 mogą zwiastować paradigm Zarządzanie tym trudnym komplikacją.

Na tym tle nasze badanie koncentruje się na ocenie krótkoterminowych skutków inhibitora SGLT-2 (dapagliflozyna lub empagliflozyny) terapii na pomiary związane z neuropatią cukrzycową, markery radykalne hydroksylowe, nieprawidłowe albuminuria i rbc-parametry . W szczególności staramy się ustalić, czy czterotygodniowa terapia inhibitora SGLT-2 może powodować wymierne zmiany funkcji neuropatycznej wśród pacjentów z T2D z wczesnymi lub łagodnymi nieprawidłowościami oraz przegląd, w jaki sposób zmiany markerów rodników hydroksylowych odnoszą się do tych wyników klinicznych i laboratoryjnych.

Materiały i metody

Badana populacja, kryteria włączenia/wykluczenia W badaniu włączono 40 dorosłych pacjentów z T2D. Kwalifikujący się uczestnicy byli osoby, dla których oprócz podawania istniejącego schematu przeciwcukrzycowego lekarz lekalny postanowił zainicjować terapię inhibitora SGLT-2 (empagliflozyna lub dapagliflozyna) w oparciu o standardowe wskazania kliniczne.

Badanie obejmowało pacjentów z T2D w wieku od 18 do 75 lat z HbA1c <10% i EGFR> 30 ml/min/1,73 M2. Spośród 40 pacjentów żaden z nich nie zgłosił bolesnej neuropatii (kwestionariusz DN4), 9 wykazywało neuropatyczne objawy czuciowe (kwestionariusz NTSS), a 9 wykazało utratę wrażeń ochronnych (test monofilamentowy). Zgodnie z wynikiem niepełnosprawności neuropatii (NDS) 14 pacjentów miało łagodną neuropatię, 16 miało umiarkowaną neuropatię, a 4 miało ciężką neuropatię, co wskazuje, że większość pacjentów miała wcześniejszą bezobjawową neuropatię. Pacjenci zostali wykluczeni w przypadku neuropatii etiologii nie cukrzycy (tj. Dziedzicznej, indukowanej przez leki lub toksyny, nietraktowanej niedoczynności tarczycy, niedobór kwoty foliowej (poniżej 3,9 µg/l), niedobór witaminy B12 (poniżej 200 ng/l), zaawansowany zaawansowany Choroba wątrobowa - nie spełniają kryteriów włączenia, choroby autoimmunologicznej, nowotworów złośliwych lub jeśli byli zaangażowani w regularne nadmierne spożywanie alkoholu (więcej niż dwie jednostki u mężczyzn i więcej niż jedna jednostka dziennie u kobiet - jedna jednostka jest zdefiniowana jako 15 g of of of of z. czysty alkohol). Wykluczono również pacjentów z ciężką chorobą tętnic obwodowych, historią owrzodzenia stóp lub nawracającymi infekcjami narządów płciowych.

Projektowanie i cele badań To prospektywne, otwarte, jednoramienne badanie kliniczne miało na celu zbadanie krótkoterminowych skutków inhibitorów cotransportera sodu-glukozy-2 (SGLT-2) na dystalną symetryczną polanową cukrzycową, markerów radykalnych hydroksyl oraz parametry nerek u pacjentów z cukrzycą typu 2 (T2D). Uzasadnienie opierało się na przypuszczalnym mechanizmie, w którym, poza ich działaniem obniżającym glukozę, inhibitory SGLT-2 mogą wpływać na tworzenie markerów rodników hydroksylowych, a tym samym poprawić powikłania mikronaczyniowe. Obejmuje to potencjalne korzyści parametrów czerwonych krwinek (RBC), nieprawidłowej albuminurii i neuropatii cukrzycowej na wczesnym etapie. Główna hipoteza była taka, że ​​krótkoterminowa terapia inhibitora SGLT-2 złagodzi szlaki hydroksylowych wolnych rodników, szczególnie stosunki metabolitu tyrozynowego, które towarzyszą poprawie pomiarów neuropatycznych i wskaźników związanych z RBC.

Protokół interwencji i badań Wszyscy uczestnicy przeszli ocenę wyjściową (tydzień 0), a następnie ocenę kontrolną po 4 tygodniach terapii inhibitora SGLT-2. Dawkę i wybór inhibitora SGLT-2 określono przez zespół kliniczny na podstawie standardowych wskazań leczenia. Badanie nie nakazali żadnych dodatkowych interwencji.

Zbieranie danych i kwestionariusze Uczestnicy wypełnili kwestionariusze stylu życia i leków na początku, dokumentując dietę, ćwiczenia, palenie i nawyki alkoholowe, jednocześnie leki i choroby współistniejące. Neuropatyczny wynik objawów (NTSS) i kwestionariusze DN4 podano w celu oceny subiektywnych dolegliwości neuropatycznych.

Oceny neuropatyczne Ocena neuropatii przeprowadzono w centrum neuropatii 2. Departamentu Medycyny i Nefrologii-Diabetes Center, University of Pécs Medical School, przy użyciu systemu opartego na oprogramowaniu CA-12 (MSB-Met Ltd., Balatonfüred, Węgier). Ilościowe testy sensoryczne przeprowadzono w celu pomiaru progów percepcji prądu (CPT) przy trzech częstotliwościach (2000 Hz, 250 Hz i 5 Hz) zarówno na nerwu mediany, jak i nerwu peronealnego, zapewniając wgląd w duże mielinowane (2000 Hz Aβ), średniej wielkości mielinowanej (250 Hz (250 Hz (250 Hz (250 Hz Aδ) i niemielinowane (5Hz C) Funkcja małych włókien. Wartości CPT poniżej zakresu normalnego wskazują na hiperestezję, a wartości powyżej normalnego zakresu wskazują na hipoestezję.

Przeprowadzono dodatkowe badania kliniczne dla dystalnej polineuropatii symetrycznej (DSPN):

1. Testy odruchowe ścięgna głębokiego i skalibrowane strojenie widelec (wibracje) 128 Hz dla dysfunkcji dużych włókien, i
2. Pinprick (ból) i percepcja temperatury dla dysfunkcji małych włókien. Ocena monofilamentu 10 G (wrażenia ochronna) pod kątem ryzyka rozwoju owrzodzeń stóp DSPN jest jednym z najczęstszych powikłań u pacjentów z cukrzycą typu 2 (T2D), nawet z dobrze kontrolowaną glikemią. DSPN może wpływać na małe lub duże włókna nerwowe lub kombinację obu w sposób zależny od długości, w rozkładowi „szklarni pończoch”.

Pomiary laboratoryjne próbki krwi i moczu zebrano na początku i w 4 tygodniu. Nie wymagała żadnej dodatkowej nejdzie poza rutynowym pobieraniem próbek; Około 10 ml krwi uzyskano do celów badawczych.

Rutynowe parametry HBA1C mierzono w tygodniu 0. Fructosamina w surowicy, glukozę na czczo i insulinę w surowicy mierzono zarówno w tygodniu 0, jak i 4. Kreatynina w surowicy i szacowany szybkość filtracji kłębuszkowej (EGFR) oceniono w tygodniu 0 i tygodniu 4. , AST, ALT, GGT, ALP, LDH, INR, białko całkowite w surowicy, albumina, całkowitym cholesterolu, HDL, LDL, żelazo z kwasem moczowym, transferina, nasycenie transferryny i ferrytyna w tygodniu 0, Whereas Triglicerydes, surowicy, sodu w surowicy, Szybkość sedymentacji potasu, erytrocytów (ESR), białko C-reaktywne (CRP) oraz albumina moczowa i kreatynina mierzono zarówno w tygodniu 0, jak i 4.

Markery wolnych rodników hydroksylowych do eksploracji szlaku wolnego rodnika hydroksylowego i jego powiązania z neuropatią, formacją RBC i parametrów nerki, markery mierzono na początku i w 4 tygodniu w surowicy i moczu fenyloalaninie (PHE), para-tyrozyna (p- Tyr), meta-tyrozyna (M-Tyr) i orto-tyrozyna (O-Tyr), określono ilościowo metodą wysokowydajnej chromatografii cieczowej (HPLC). Oprócz bezpośrednich stężeń tych metabolitów obliczono następujące stosunki w celu scharakteryzowania zmian w środowisku oksydacyjnym w terapii inhibitora SGLT-2: P-Tyr/Phe, M-Tyr/Phe, O-Tyr/Phe, (M- (M- Tyr+O-tyr)/PHE, M-Tyr/P-Tyr, O-Tyr/P-Tyr, (M-Tyr+O-Tyr)/P-Tyr, M-Tyr/Krea, P-Tyr/Krea , O-Tyr/Krea, a także każda odpowiednia surowica i wartości moczowe. Ten kompleksowy panel produktów hydroksylacji i współczynników pochodnych miał na celu przedstawienie szczegółowej oceny aktywności hydroksylowej wolnej rodników i jej potencjalnego wpływu na powikłania cukrzycowe.

Dodatkowe obliczenia obliczono ocenę modelu homeostazy oporności na insulinę (HOMA-IR) w celu oceny wrażliwości na insulinę. Zmiany w stosunku albuminy moczowej/kreatyniny (ACR) i korelacje z parametrami progu progu progu postrzegania (CPT) zostały również ocenione w całym badaniu.

Wynik niepełnosprawności neuropatii (NDS) obliczono przy użyciu znormalizowanego podejścia do badania klinicznego. Ta ocena ocenia refleksy kostki, odczucia wibracji, odczucia PIN-Pick i uczucie temperatury na dużym palcu. Maksymalny całkowity wynik to 10, skategoryzowany w następujący sposób:

3-5 punktów: łagodna neuropatia 6-8 punktów: Umiarkowana neuropatia 9-10 punktów: Ciężka neuropatia

Analizy o wysokiej wydajności chromatografii cieczowej (HPLC) krew żylna pobrano od pacjentów do natywnych rur podczas rutynowego pobierania próbek krwi. Surowicę ekstrahowano przez wirowanie i przechowywano w temperaturze -80 ° C do czasu dalszego badania. Następnie do 500 µl surowicy dodano 125 µl kwasu trichloro octacyjnego (TCA), a następnie próbki inkubowano na lodzie przez 30 minut. Następnie osad oddzielono przez wirowanie i supernatant przefiltrowano za pomocą filtra strzykawki 0,2 μm (Millipore Inc.). Supernatant przechowywano w temperaturze -80 ° C aż do dalszego procesu lub natychmiast analizowano za pomocą HPLC. Analizę HPLC przeprowadzono przy użyciu urządzenia Shimadzu Class LC-10 Advp HPLC (Shimadzu Manufacturing Inc., USA). 20 μl filtratu wstrzyknięto na kolumnę krzemionki licrosfer-C18 (Merck). Różne aminokwasy i izomery: fenyloalanina (PHE), para-tyrozyna (P-Tyr), meta-tyrozyna (M-Tyr), orto-tyrozyna (O-Tyr) wykryto przy użyciu ich autofluorescencji. P-, M-, O-Tyr mierzono przy wzbudzeniu 275 nm i emisji 305 nm, podczas gdy PHE oceniono przy wzbudzeniu 258 nm i emisji 288 nm przy użyciu detektora fluorescencyjnego Shimadzu RF-10AXL. Przeprowadzono izochratyczny przepływ eluentu zawierający 1% kwas octowy, 1% octanu sodu i 98% wody destylowanej. Do określenia stężeń różnych aminokwasów i izomerów zastosowano standardy zewnętrzne.

Dane analizy statystycznej analizowano metodą biostatystyki przy użyciu odpowiednich metod dla par sparowanych, a także analiz korelacji i regresji w celu zidentyfikowania potencjalnych predyktorów zmiany neuropatii, parametrów związanych z rodnikiem hydroksylowym i parametrów metabolicznych. Analizy podgrup dokonały przeglądu pacjentów z nieprawidłowymi wyjściowymi wartościami CPT w celu rozpoznania, czy terapia inhibitora SGLT-2 może przynieść większe korzyści neurologiczne u pacjentów z wcześniej istniejącymi zmianami neuropatycznymi. Rozkład parametrów przetestowano przy użyciu testu normalności Kolmogorowa-Smirnova. Zmiany parametrów między wartością wyjściową a tygodniem 4 porównano przy użyciu sparowanego testu t próbki.

Analizy korelacyjne przeprowadzono za pomocą testów Pearsona (rozkład normalny) lub Rho Spearmana (nieformalny rozkład). Modele regresji liniowej z metodą stopniową ustalono do oceny predyktorów neuropatii, parametrów RBC i albuminurii. Do analiz statystycznych wykorzystano pakiet statystyczny dla nauk społecznych (SPSS) (IBM, Armonk, Nowy Jork, Stany Zjednoczone). Wartość „P” poniżej 0,05 uznano za statystycznie istotną.

Podsumowując, metody zostały zaprojektowane w celu zbadania, czy terapia krótkoterminowa inhibitor SGLT-2, poprzez zmniejszenie generowania wolnego rodnika hydroksylowego i poprawa wskaźników RBC i nieprawidłowa albuminuria, może również dawać mierzalną poprawę diabetycznej funkcji neuropatycznej i powiązanych rodników hydroksylowych.