Mokre i suche biomarkery do przewidywania wtórnego uszkodzenia w udarze mózgu: od laboratorium do łóżka pacjenta - Badanie NIMBLE (NIMBLE)

TŁO Wzrost zawału (IG), krwotoczne przekształcenie (HT) oraz obrzęk mózgu (CE) są kluczowymi czynnikami związanymi z niekorzystnym wynikiem u pacjentów z udarem niedokrwiennym, pomimo sukcesu rekanalizacji. Bezskuteczna reperfuzja i uszkodzenie reperfuzyjne są powiązane z tymi szkodliwymi zjawiskami, ale ich mechanizmy pozostają w dużej mierze nieznane, w związku z czym trudno je przewidzieć i zahamować. Różne badania wykazały, że niektóre krążące biomarkery są związane z rozwojem IG, HT i CE.

Badanie NIMBLE (Integrating novel NeuroImaging Measurements and circulating Biomarkers for the prediction of secondary injury foLlowing strokE: from bench to bedside) jest projektem translacyjnym obejmującym badania kliniczne na ludziach oraz badanie eksperymentalne na zwierzętach. Ma na celu zbadanie możliwych czynników przyczyniających się do IG, HT i CE po niedokrwieniu poprzez badanie krążących biomarkerów w odniesieniu do nieprawidłowości w neuroobrazowaniu i wyników funkcjonalnych u ludzi. U myszy krążące biomarkery są badane w odniesieniu do reorganizacji neuronalnej na poziomie komórkowym i subkomórkowym oraz do eksperymentalnej oceny CE.

USTAWIENIE KLINICZNE

Projekt badania:

Jednoośrodkowe, podłużne, prospektywne badanie obserwacyjne z kontynuacją, rekrutujące kolejną serię pacjentów z przednim ostrym udarem niedokrwiennym zgłaszających się w ciągu 12 godzin od wystąpienia objawów na oddział ratunkowy, leczonych lub nieleczonych terapiami rewaskularyzacyjnymi.

Wszyscy pacjenci przechodzą ocenę neuroobrazowania oraz pobieranie krwi do oznaczenia kilku krążących biomarkerów surowicy (szczegóły poniżej).

Rekrutacja pacjentów odbywała się między 24.04.2021 a 30.06.2023, łącznie 213 pacjentów, mediana wieku [IQR (zakres międzykwartylowy)] 80 [16] lat, 46% kobiet, mediana podstawowej skali NIHSS (National Institutes of Health Stroke Scale) [IQR] 10 [3].

Metodologia pracy:

Ocena kliniczna:

Pełny zakres danych klinicznych, w tym czynniki ryzyka udaru, leczenie ostrego udaru, leki przed udarem, jest rejestrowany dla każdego pacjenta. Ciężkość udaru mierzy się za pomocą NIHSS na początku oraz w 1., 7. i 90. dniu obserwacji, a niepełnosprawność po udarze za pomocą zmodyfikowanej skali Rankina (mRS) przeprowadzanej w 3. miesiącu podczas wizyty lub rozmowy telefonicznej.

Ocena neuroradiologiczna:

Ocena neuroradiologiczna jest zaślepiona względem danych klinicznych. Obrazowanie mózgu obejmuje podstawowe zwykłe TK oraz, jeśli jest to klinicznie wskazane, wielofazową angiografię TK i perfuzję TK na początku. Wykonuje się TK po 24 godzinach oraz MRI bez kontrastu po 5 dniach (w tym sekwencje obrazowania ważonego dyfuzyjnie (DWI), pozornego współczynnika dyfuzji (ADC), tłumienia sygnału płynu w odwróceniu odzysku (FLAIR) i szybkiego echa pola (FFE)).

Wczesne objawy niedokrwienne (wynik Alberta Stroke Programme Early CT [ASPECTS]), obecność i ciężkość choroby małych naczyń, obecność i stopień CE i HT są oceniane przez dwóch neuroradiologów na podstawie skanów TK na początku i w trakcie obserwacji.

CE jest klasyfikowany zgodnie z kryteriami SITS-ISTR (Safe Implementation of Treatments in Stroke - International Stroke Thrombolysis Register):

COED1 = ogniskowy obrzęk mózgu do jednej trzeciej półkuli, COED2 = ogniskowy obrzęk mózgu większy niż jedna trzecia półkuli, COED3 = obrzęk mózgu z przesunięciem linii środkowej, NONE = brak obrzęku mózgu.

HT jest oceniany zgodnie z radiograficzną klasyfikacją ECASS (European Cooperative Acute Stroke Study):

HI-1: Zawał krwotoczny typu 1 = małe wybroczyny HI-2: Zawał krwotoczny typu 2 = bardziej zlewające się wybroczyny PH-1: Krwiak śródmózgowy typu 1 = <30% obszaru zawału z łagodnym efektem zajmowania przestrzeni PH-2: Krwiak śródmózgowy typu 2 = >30% obszaru zawału z istotnym efektem zajmowania przestrzeni Dane perfuzyjne uzyskane zgodnie z lokalnym protokołem klinicznym są oceniane przez doświadczonego neuroradiologa w celu wykrycia rdzenia zawału i objętości niedokrwienia.

Ponadto przeprowadza się charakterystykę obrzęku za pomocą MRI w celu różnicowania obrzęku naczyniopochodnego od obrzęku cytotoksycznego, analizując charakterystykę sygnału i morfologię zmiany.

Stosuje się również nową metodę ilościowego określania obrzęku mózgu (wywołanego przez CE i HT) oraz definiowania wzrostu zmiany i ostatecznej objętości zawału, zwaną Anatomicznym Zniekształceniem (AD).

Dwóch doświadczonych operatorów niezależnie stworzy ręczne mapowanie („maskę”) zmiany niedokrwiennej widocznej na skanie TK po 24 godzinach. Operator zdefiniuje również „maskę” zmiany na skanie MRI (Magnetic Resonance Imaging) po 5 dniach (używając sekwencji DWI). Wszelkie rozbieżności zostaną rozstrzygnięte przez oddzielnego neuroradiologa. Do tego procesu zostanie użyte FSLeyes, oprogramowanie zawarte w oprogramowaniu FSL (FMRIB [Functional Magnetic Resonance Imaging of the Brain] Software Library v6.0, stworzone przez Analysis Group, FMRIB, Oxford, Wielka Brytania), które umożliwia generowanie trójwymiarowej maski zmiany dla każdego pacjenta, obejmującej tkankę zawału na wszystkich sekcjach TK. Poprzednie/nieostre zmiany niedokrwienne (już obecne na początkowym TK) nie będą włączane do masek.

AD będzie oceniane przez porównanie początkowego TK ze skanami TK po 24 godzinach i MRI po 5 dniach. Kroki wymagane do uzyskania tego pomiaru obejmują zarysowanie zmiany niedokrwiennej widocznej na skanach kontrolnych za pomocą „maski” (opisanej wcześniej) oraz rejestrację, procedurę umożliwiającą dokładne porównanie różnych obrazów mózgu, nawet w różnych czasach i u różnych osób. AD można obliczyć, porównując dwa możliwe podejścia do rejestracji, a w szczególności poprzez ilościowe określenie różnicy między maskami zmiany przetworzonymi za pomocą rejestracji liniowej i nieliniowej zgodnie z metodą opisaną przez Harstona w 2018 roku. Wszystkie przetwarzanie i analiza obrazów będą przeprowadzane przy użyciu oprogramowania FSL (FMRIB Software Library v6.0, stworzonego przez Analysis Group, FMRIB, Oxford, Wielka Brytania), darmowego oprogramowania opracowanego przez grupę badawczą Uniwersytetu Oksfordzkiego. Odejmując AD od całkowitej objętości zmiany, badacze mogą uzyskać skorygowaną objętość zawału.

Protokół laboratoryjny:

Pomiary biomarkerów są zaślepione względem danych klinicznych. U wszystkich pacjentów następujące poziomy surowicze biomarkerów związanych ze stanem zapalnym, uszkodzeniem bariery krew-mózg i uszkodzeniem reperfuzyjnym są mierzone przy przyjęciu i po 24 godzinach.

Można je podzielić na trzy grupy według rodzaju i szybkości techniki pomiarowej:

• szybko dostępne cząsteczki: alfa-2-makroglobulina (A2M); białko amyloidu A w surowicy (SAA); haptoglobina (Hp); białko C-reaktywne wysokiej czułości (hsCRP); enolaza specyficzna dla neuronów (NSE); S100Beta (S100B)
• biomarkery wymagające dłuższego czasu do pomiaru: cytokiny i chemokiny pro- i przeciwzapalne, metaloproteinazy macierzy (MMPs) i ich inhibitory (TIMPs), czynnik von Willebranda (vWF), markery dysfunkcji śródbłonka i białka połączeń ścisłych.
• Biomarkery metabolomiczne i lipoproteomiczne

Wszystkie dane są zgłaszane w dedykowanym formularzu raportowania przypadków (CRF).

Miary wyniku

Główna miara wyniku:

1. Wzrost zawału, krwotoczne przekształcenie i obrzęk mózgu

   Dodatkowa miara wyniku:

2. Wynik funkcjonalny Wynik funkcjonalny będzie oceniany poprzez pomiar zmodyfikowanej skali Rankina 3 miesiące po wystąpieniu ostrego udaru niedokrwiennego.

Plan analizy statystycznej:

Przeprowadzone zostaną jednoczynnikowe analizy regresji liniowej w celu oceny związku między każdym głównym wynikiem radiologicznym a wybranymi zmiennymi wyjściowymi (w tym krążącymi biomarkerami). Zmienne niezależne związane z wynikiem w analizie jednoczynnikowej zostaną uwzględnione w modelach wieloczynnikowych.

W innej analizie zostaną stworzone jednoczynnikowe modele regresji logistycznej w celu oceny związku między wyjściowymi krążącymi i radiologicznymi biomarkerami oraz zmiennymi klinicznymi a dychotomicznym wynikiem mRS zarejestrowanym po trzech miesiącach. Czynniki ryzyka uznane za istotne w analizie jednoczynnikowej wejdą do wieloczynnikowego modelu regresji logistycznej z kryterium selekcji wstecznej.

USTAWIENIE PRZEDKLINICZNE

Oświadczenie etyczne badań przedklinicznych:

Wszystkie procedury dotyczące myszy są wykonywane zgodnie z przepisami włoskiego Ministerstwa Zdrowia, autoryzacja nr 723/2019.

Myszy są trzymane w przezroczystych plastikowych klatkach w cyklu 12-godzinnego światła/ciemności i mają swobodny dostęp do wody i pożywienia. Badacze używają transgenicznej linii myszy, C57BL/6J-Tg(Thy1-EGFP)MJrs/J, z Jackson Laboratories (Bar Harbor, Maine, USA).

Model myszy z niedrożnością i rekanalizacją środkowej tętnicy mózgowej (MCA):

W tym projekcie stosuje się nową metodę przejściowej fototrombotycznej niedrożności dystalnej MCA opracowaną przez naszą grupę. Krótko mówiąc, fototrombotyczną niedrożność MCA wykonuje się poprzez napromieniowanie dystalnej MCA skupionym zielonym laserem po dootrzewnowym wstrzyknięciu barwnika światłoczułego róży bengalskiej. W wybranych czasach po niedrożności MCA (30 min, 60 min, 90 min) rekanalizację przeprowadza się poprzez napromieniowanie niedrożnej dystalnej MCA diodą UV (Ultraviolet) zdolną do rozerwania wiązań fibrynowych wewnątrz skrzepu.

Obrazowanie dendrytów i unaczynienia in vivo za pomocą dwufotonowym:

Badana jest plastyczność strukturalna aksonów i dendrytów w ostrej fazie po udarze w porównaniu z warunkami przed udarem. U myszy Thy1-GFP wykonuje się okienko czaszkowe na obszarze okołozawałowym, aby umożliwić stały dostęp optyczny do kory myszy. Powierzchowne naczynia krwionośne okienka czaszkowego są używane jako punkt orientacyjny do ponownego odnalezienia tego samego regionu kory w różnych sesjach obrazowania, przeprowadzając podłużne badanie obrotu zakończeń synaptycznych i orientacji procesów neuronalnych. Ponadto charakteryzuje się przepuszczalność naczyń na poziomie kapilarnym. W tym celu wykonuje się ogólnoustrojowe wstrzyknięcie barwnika fluorescencyjnego (np. Texas Red Dextran, Thermo Fisher Scientific, USA) do żyły ogonowej myszy tuż przed sesją obrazowania. Ten barwnik jest żywotny przez kilka godzin po wstrzyknięciu i dyfunduje do miąższu tylko wtedy i tam, gdzie dochodzi do wynaczynienia. Następnie co 5 minut od natychmiast po wstrzyknięciu do 30 minut po wstrzyknięciu pozyskuje się stosy obrazowania znakowanego unaczynienia. Aby ocenić przepuszczalność naczyń krwionośnych in vivo, wykonuje się pomiar średnich wartości fluorescencji w kwadratowym obszarze zainteresowania wyśrodkowanym wewnątrz lub tuż na zewnątrz naczynia krwionośnego i powtarza się pomiar w tej samej lokalizacji w różnych punktach czasowych po wstrzyknięciu. Przepuszczalność κ(t) będzie obliczana zgodnie z następującym wzorem opisanym przez Nhana w 2013 roku: [κ(t) = (dIe/dt)/[(Ii(t)/0,55)-(Ie(t)/(Ve/Vi)].

Obrzęk:

24 godziny po indukcji udaru oblicza się zawartość wody w mózgu, jako pośredni pomiar obrzęku mózgu, u poświęconych myszy, zgodnie z Kenne i współpracownikami. Mózg dzieli się wzdłuż linii środkowej, a tkanki przeciwstronne i po tej samej stronie są ważone bezpośrednio po usunięciu, aby uzyskać wagę mokrą (WW). Tkanki są suszone w 60°C przez 72 godziny i ważone, aby uzyskać wagę suchą (DW). Zawartość wody oblicza się jako procent wagi mokrej; % zawartości wody = [(WW-DW)/(WW)]*100.

Badanie krążących biomarkerów:

Aby przetestować w różnych punktach czasowych (przed udarem, na początku i 24 godziny po niedrożności) te same biomarkery krwi oceniane u pacjentów, krew jest pobierana przez zatokę oczodołową u znieczulonych myszy.

Analizy statystyczne:

Próbka zostanie podzielona na trzy grupy eksperymentalne (Sham, No-Recanalized i Recanalized). Do określenia wielkości próby badacze użyją testu ANOVA (efekty stałe, omnibus, jednoczynnikowy) i następujących danych: 3 grupy eksperymentalne, wielkość efektu f = 0,5, α = 0,05, Moc = 0,8 (użyte oprogramowanie G*Power, wersja 3.1.9.2, Franz Faul, University of Kiel, Niemcy). Dane myszy z trzech grup będą porównywane w różnych punktach czasowych (przed udarem, na początku i 24 godziny po udarze). Jednoczynnikowa analiza wariancji (ANOVA) z powtarzanymi pomiarami zostanie przeprowadzona na danych z obrazowania dwufotonowego w celu oceny obrotu synaptycznego i przepuszczalności bariery krew-mózg naczyń krwionośnych kory w różnych punktach czasowych. Dane będą podawane jako średnia ± błąd standardowy średniej.

Finansowanie:

• Region Toskanii „Bando Salute 2018”;
• #NEXTGENERATIONEU (NGEU) i finansowane przez Ministerstwo Uniwersytetów i Badań (MUR), Narodowy Plan Odbudowy i Odporności (NRRP), projekt MNESYS (PE0000006) - Zintegrowane podejście wieloskalowe do badania układu nerwowego w zdrowiu i chorobie (DN. 1553 11.10.2022).