Zakażenia wywołane przez Enterobacteriaceae wytwarzające ESbL we Włoszech

PLAN I METODOLOGIA BADAŃ

Populacja Wszyscy pacjenci z zakażeniami (tj. bakteriemia, zapalenie płuc, infekcje jamy brzusznej, infekcje skóry i infekcje dróg moczowych) wywołane przez Enterobacteriaceae wytwarzające ESBL.

Kryteria wykluczenia Dzieci < 16 lat

Projekt badania Wieloośrodkowe prospektywne badanie kohortowe. Pacjenci odpowiadający definicji badania będą wykrywani przez codzienną kontrolę mikrobiologicznych baz danych przez jednego dedykowanego lekarza. Zmienne epidemiologiczne zostaną wykryte dla wszystkich pacjentów przy przyjęciu do badania. Aby zidentyfikować czynniki ryzyka infekcji (tj. bakteriemia, zapalenie płuc, infekcje jamy brzusznej, infekcje skóry i infekcje dróg moczowych) wywołane przez Enterobacteriaceae wytwarzające ESBL, zostanie przeprowadzone badanie kliniczno-kontrolne. Pacjent z danym przypadkiem zostanie zdefiniowany jako dorosły pacjent ( 16 lat), który ma infekcję wywołaną przez Enterobacteriaceae wytwarzające ESBL zgodnie z definicjami Centrum Kontroli i Zapobiegania Chorobom w Atlancie (CDC). W Laboratoriach Mikrobiologii Klinicznej produkcja ESBL przez Laboratoria Mikrobiologii Klinicznej będzie zgodna z wytycznymi CLSI (3) lub z wytycznymi BSAC (http://www.bsac.org.uk) dla gatunków innych niż Klebsiella spp. ., E. coli i Proteus mirabilis. Dla każdego przypadku zostanie wybrana jedna kontrola. Kontrola zostanie wybrana spośród wszystkich dorosłych pacjentów przyjętych do tego samego szpitala w tym samym okresie (w ciągu 30 dni), u których nie wyizolowano Enterobacteriaceae wytwarzających ESBL podczas pobytu w szpitalu. Jeśli na przypadek będzie dostępna więcej niż jedna kontrola, wybrani zostaną pacjenci z datą i godziną przyjęcia najbardziej zbliżoną do przypadku.

Aby zidentyfikować czynniki ryzyka śmiertelności, zostanie przeprowadzone drugie badanie kliniczno-kontrolne porównujące zakażonych pacjentów, którzy zmarli, z zakażonymi pacjentami, którzy przeżyli (możliwość oceny tylko u pacjentów z bakteriemią, infekcjami ran, zapaleniem płuc i zapaleniem opon mózgowych). Ta analiza zostanie przeprowadzona w celu dostosowania wyników pod kątem nieodpowiedniej empirycznej terapii przeciwbakteryjnej i miejsca zakażenia (patrz definicje poniżej).

Gromadzenie danych Dokonany zostanie przegląd dokumentacji medycznej dotyczącej przyjęć pacjentów do szpitala oraz baz danych mikrobiologicznych i aptecznych. Dane zbierane podczas rejestracji do badania będą obejmować: dane demograficzne pacjenta, przeniesienie z innego szpitala, rezydenta placówki długoterminowej lub domu opieki, poprzednią hospitalizację w ciągu jednego roku, status ambulatoryjny, konieczność przewlekłej hemodializy, obecność centralnego cewnika żylnego (CVC) oraz pobytu na OIT i zabiegów chirurgicznych w ciągu 30 dni przed włączeniem do badania. Złożony wynik chorób współistniejących zostanie uzyskany przy użyciu wyniku Charlsona. Nasilenie choroby w momencie prezentacji zostanie określone ilościowo przy użyciu kryteriów McCabe'a i Jacksona. Antybiotyki podawane w okresie 30 dni przed włączeniem do badania i przez co najmniej 48 godzin zostaną zarejestrowane. W celu analizy czynników ryzyka ekspozycja na antybiotyki po podaniu doustnym i dożylnym zostanie przeanalizowana w podziale na poszczególne antybiotyki i klasy, i będzie obejmować penicyliny, wankomycynę, cefalosporyny, antybiotyki o działaniu głównie beztlenowym (metronidazol i klindamycyna), aminoglikozydy, chinolony i karbapenemy. Długość pobytu (LOS) po rozpoznaniu zakażenia, postępowanie w przypadku zakażenia, czas i rodzaj leczenia przeciwdrobnoustrojowego, wyniki dalszych posiewów klinicznych (jeśli takie istnieją), powikłania krwiopochodne i zgon również zostaną wyodrębnione z dokumentacji medycznej. Dokumentacja mikrobiologiczna zostanie również przejrzana pod kątem wykrycia enterokoków opornych na wankomycynę (VRE) lub S. aureus opornych na metycylinę (MRSA) w ciągu 12 miesięcy przed włączeniem do badania. Wszyscy pacjenci z zakażeniami wywołanymi przez Enterobacteriaceae wytwarzające ESBL będą monitorowani aż do wypisu ze szpitala lub śmierci.

Śmiertelność zostanie zdefiniowana jako zgon występujący podczas hospitalizacji w ramach badania. Właściwa terapia przeciwdrobnoustrojowa będzie zdefiniowana jako rozpoczęcie terapii z aktywnością przeciwko Enterobacteriaceae wytwarzającym ESBL (zgodnie z wynikami wzorca wrażliwości izolatu na antybiotyki) od dnia poprzedzającego do 2 dni po początkowym dodatnim wyniku posiewu klinicznego.

Wyniki Podstawowe wyniki

1. Czynniki ryzyka rozwoju zakażeń wywołanych przez bakterie wytwarzające ESBL;
2. Czynniki ryzyka nieodpowiedniej początkowej terapii przeciwdrobnoustrojowej;
3. śmiertelność ogólna i śmiertelność 30-dniowa wśród pacjentów otrzymujących nieodpowiednią początkową terapię przeciwdrobnoustrojową (możliwość oceny wyłącznie u pacjentów z bakteriemią, infekcjami jamy brzusznej i zapaleniem płuc);
4. Zmienność w zależności od miejsca zakażenia śmiertelności ogólnej i śmiertelności 30-dniowej wśród pacjentów otrzymujących nieodpowiednią początkową terapię przeciwdrobnoustrojową (możliwa do oceny tylko u pacjentów z bakteriemią, infekcjami jamy brzusznej i zapaleniem płuc).

Wyniki drugorzędne

1. Długość hospitalizacji;
2. Koszty nieodpowiedniej terapii początkowej;
3. Dni odroczenia.

Analiza statystyczna Na koniec badania zostaną przeprowadzone dwie różne analizy: pierwsza dotyczy pacjentów z bakteriemią, infekcjami jamy brzusznej i zapaleniem płuc i będzie koncentrować się na śmiertelności; druga analiza obejmie wszystkich zakażonych pacjentów i będzie koncentrować się na analizie czynników ryzyka i drugorzędnych wynikach.

Uzasadnienie wielkości próby Założenia

Pacjenci z bakteriemią, zapaleniem płuc, zakażeniami jamy brzusznej, zakażeniami skóry i zakażeniami dróg moczowych (pierwsza analiza):

Śmiertelność wśród pacjentów z nieodpowiednią terapią początkową: 25% Śmiertelność wśród pacjentów z odpowiednią terapią początkową: 13%

Wszyscy uwzględnieni pacjenci:

Procent bakteriemii: 20% Procent zapalenia płuc: 10% Procent infekcji jamy brzusznej: 15% Procent infekcji skóry: 3% Procent infekcji dróg moczowych: 52%

Główne wyniki Czynniki ryzyka śmiertelności Różnica śmiertelności między grupą kontrolną (niewłaściwa terapia) a przypadkami (właściwa terapia): spodziewaliśmy się zmniejszenia z 25% do 13%.

Wyniki drugorzędne Różnica długości hospitalizacji pomiędzy przypadkami (właściwa terapia) a grupą kontrolną (niewłaściwa terapia): przewidywaliśmy spadek z 80% (długość hospitalizacji < 15 dni) do 40%.

Różnica w odroczeniu między przypadkami (odpowiednia terapia) a grupą kontrolną (nieodpowiednia terapia): przewidywaliśmy spadek z 85% (odroczenie <3 dni) do 30%.

Zakładając, że p1=p2, gdzie p1 to odsetek w populacji 1, a p2 to odsetek w populacji 2, a alfa=0,05 (dwustronne), potęga=0,80.

Wymagana wielkość próby do analizy czynników ryzyka zgonu: 366 pacjentów z bakteriemią, infekcjami ran, zapaleniem płuc i zapaleniem opon mózgowych. Aby uwzględnić 366 pacjentów z wyżej opisanymi infekcjami, całkowita wielkość próby prawdopodobnie wyniesie 813 pacjentów zakażonych Enterobacteriaceae wytwarzającymi ESBL.

Analiza mikrobiologiczna szczepów bakteryjnych

Wszystkie izolaty wytwarzające ESBL uzyskane od pacjentów włączonych do badania w Klinicznych Laboratoriach Mikrobiologicznych każdego Centrum Klinicznego zostaną zebrane i poddane dalszym badaniom, w tym:

• potwierdzenie identyfikacji na poziomie gatunku;
• określenie profilu oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe w stosunku do standardowego zestawu leków;
• analiza uwarunkowań ESBL;
• analiza pokrewieństwa klonalnego między izolatami bakteryjnymi tego samego gatunku. Wyniki analizy mikrobiologicznej zostaną wykorzystane do korelacji z danymi klinicznymi w celu oceny wpływu epidemiologicznego i klinicznego szczepów wytwarzających ESBL.

Metodologia eksperymentalna

Potwierdzenie identyfikacji izolatów bakteryjnych na poziomie gatunku zostanie przeprowadzone standardowymi metodami fenotypowymi (10). W przypadku niejasności wyników identyfikacja zostanie potwierdzona sekwencjonowaniem 16S rDNA (16).

Badanie wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe zostanie przeprowadzone za pomocą mikrorozcieńczeń bulionu zgodnie z zaleceniami CLSI (3), a kategoryczne przypisanie zostanie przeprowadzone przy użyciu punktów granicznych CLSI (3). Uwzględnione zostaną następujące leki: ertapenem, imipenem, meropenem, cefepim, ceftazydym, cefotaksym, piperacylina/tazobaktam, amoksycylina/klawulanian, cyprofloksacyna, lewofloksacyna, gentamycyna, amikacyna.

Natura determinantów ESBL zostanie zbadana za pomocą analizy molekularnej przy użyciu PCR i sekwencjonowania, jak opisano wcześniej (9, 15). Obecność determinant ESBL typu TEM-, SHV, CTX-M- i PER- (tj. mi. te, o których wiadomo, że krążą we Włoszech (9, 15)) zostaną zbadane. W przypadku negatywnych wyników z dostępnymi sondami, fenotyp ESBL zostanie ponownie potwierdzony, a jeśli pozytywny, natura deerminantów -laktamaz zostanie zbadana za pomocą: (i) analitycznego ogniskowania izoelektrycznego (IEF) na surowych ekstraktach przy użyciu wcześniej opisanych metody (14); (ii) Technologia mikromacierzy DNA, wykorzystująca mikromacierz dla genów β-laktamazy, która została opracowana w naszym laboratorium, która obejmuje sondy dla rzadkich genów ESBL, takich jak enzymy VEB, GES, BES, SFO i TLA. W przypadku nowych genów ESBL niewykrytych powyższymi metodami (zdarzenie mało prawdopodobne). poprzez mapowanie i sekwencjonowanie.

Pokrewieństwo klonalne między izolatami tego samego gatunku będzie badane za pomocą wysokowydajnych technik genotypowania, takich jak RAPD (losowo amplifikowany polimorficzny DNA) i/lub analiza AFLP (polimorfizm długości amplifikowanych fragmentów) i/lub REP PCR (19-21). W wybranych izolatach pokrewieństwo klonalne zostanie przeprowadzone za pomocą analizy makrorestrykcji genomowego DNA metodą elektroforezy żelowej w polu pulsacyjnym (PFGE).

Analiza plazmidów i badanie determinantów oporności na czynniki inne niż β-laktamowe (za pomocą technik molekularnych) zostaną rozważone w wybranych przypadkach, jeśli te informacje będą miały znaczenie dla korelacji z danymi klinicznymi i epidemiologicznymi.