意大利产 ESbL 肠杆菌引起的感染

研究计划和方法

人群 所有感染患者（即 产 ESBL 肠杆菌引起的菌血症、肺炎、腹部感染、皮肤感染和尿路感染）。

排除标准 16 岁以下儿童

试验设计 多中心前瞻性队列研究。 与研究定义相对应的患者将由一名专职医师通过每天检查微生物数据库来检测。 将在研究入院时检测所有患者的流行病学变量。 确定感染的危险因素（即 产 ESBL 肠杆菌引起的菌血症、肺炎、腹部感染、皮肤感染和尿路感染）将进行病例对照研究。 根据亚特兰大疾病控制和预防中心 (CDC) 的定义，病例患者将被定义为感染了产 ESBL 肠杆菌科细菌的成年患者（ 16 岁）。 在临床微生物学实验室中，临床微生物学实验室对 ESBL 生产的定义将根据 CLSI 指南 (3) 或 BSAC 指南 (http://www.bsac.org.uk) 用于克雷伯氏菌属以外的物种., 大肠杆菌和奇异变形杆菌。 将为每种情况选择一个对照。 将在同一时期（30 天内）入住同一家医院且在住院期间未分离出产 ESBL 肠杆菌科的所有成年患者中选择对照。 如果每个病例有多个对照，将选择入院日期和时间最接近病例的患者。

为了确定死亡的风险因素，将进行第二项病例对照研究，比较死亡的感染患者与幸存的感染患者（仅可在患有菌血症、伤口感染、肺炎和脑膜炎的患者中进行评估）。 将根据不充分的经验性抗微生物治疗和感染部位（见以下定义）调整结果进行分析。

数据收集 将审查住院病人的医疗记录以及微生物学和药房数据库。 在研究登记时收集的数据将包括：患者人口统计、从另一家医院转移、长期设施或疗养院的居民、一年内的先前住院情况、非卧床状态、长期血液透析的需要、中心静脉导管 (CVC) 的存在，以及研究纳入前 30 天内的 ICU 停留时间和手术程序。 将使用 Charlson 评分得出合并症的综合评分。 就诊时疾病的严重程度将使用 McCabe 和 Jackson 的标准进行量化。 将记录在研究登记前的 30 天内和至少 48 小时内服用的抗生素。 对于风险因素分析，口服和静脉内抗生素暴露将按个别抗生素和类别进行分析，包括青霉素、万古霉素、头孢菌素、主要厌氧活性的抗生素（甲硝唑和克林霉素）、氨基糖苷类、喹诺酮类和碳青霉烯类。 感染诊断后的住院时间 (LOS)、感染管理、抗菌治疗的时间和类型、后续临床培养结果（如果有）、血源性并发症和死亡也将从医疗记录中提取。 还将审查微生物学记录以了解在研究登记前 12 个月内万古霉素耐药肠球菌 (VRE) 或甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌 (MRSA) 的恢复情况。 所有因产 ESBL 肠杆菌引起感染的患者都将接受随访，直至出院或死亡。

死亡率将定义为研究住院期间发生的死亡。 适当的抗菌治疗将被定义为从最初的阳性临床培养结果前一天到后 2 天开始对产生 ESBL 的肠杆菌科（根据分离株的抗菌药敏模式的结果）具有活性的治疗。

结果 主要结果

1. 由 ESBL 生产菌引起的感染发展的危险因素；
2. 初始抗菌治疗不充分的危险因素；
3. 初始抗微生物治疗不足的患者的总体死亡率和 30 天死亡率（仅可在菌血症、腹部感染和肺炎患者中进行评估）；
4. 初始抗微生物治疗不足的患者感染部位的总体死亡率和 30 天死亡率的差异（仅可在菌血症、腹部感染和肺炎患者中进行评估）。

次要结果

1. 住院时间；
2. 初始治疗不当的费用；
3. 退热的日子。

统计分析 在研究结束时，将进行两种不同的分析：第一种将考虑患有菌血症、腹部感染和肺炎的患者，并将重点放在死亡率上；第二次分析将考虑所有受感染的患者，并将重点放在风险因素分析和次要结果上。

样本量合理性假设

菌血症、肺炎、腹部感染、皮肤感染和尿路感染患者（初步分析）：

初始治疗不充分的患者死亡率：25% 初始治疗适当的患者死亡率：13%

所有包括的患者：

菌血症百分比：20% 肺炎百分比：10% 腹部感染百分比：15% 皮肤感染百分比：3% 尿路感染百分比：52%

主要结果 死亡率的危险因素 对照组（不适当的治疗）和病例（适当的治疗）之间的死亡率差异：我们预计死亡率会从 25% 降低到 13%。

次要结果 病例（适当治疗）和对照组（不适当治疗）住院时间的差异：我们预计会从 80%（住院时间 < 15 天）降至 40%。

病例（适当治疗）和对照组（不适当治疗）之间退热的差异：我们预计会从 85%（退热 < 3 天）降至 30%。

假设 p1=p2，其中 p1 是在人口 1 中的比例，p2 是在人口 2 中的比例，并且 alpha=0.05 （双面），功率=0.80。

分析死亡风险因素所需的样本量：366 名患有菌血症、伤口感染、肺炎和脑膜炎的患者。 为了包括 366 名患有上述报告感染的患者，总样本量可能是 813 名感染产 ESBL 肠杆菌科的患者。

细菌菌株的微生物学分析

从每个临床中心的临床微生物实验室的研究中包括的患者获得的所有产 ESBL 分离株将被收集并进行进一步调查，包括：

• 确认物种水平的鉴定；
• 确定针对一组标准药物的抗菌素耐药性；
• ESBL决定因素的分析；
• 分析同种细菌分离株之间的克隆关系。 微生物分析的结果将用于与临床数据相关联，以评估产 ESBL 菌株的流行病学和临床影响。

实验方法

将通过标准表型方法 (10) 对物种水平的细菌分离物的鉴定进行确认。 如果结果不明确，将通过 16S rDNA 测序 (16) 确认鉴定。

将按照 CLSI (3) 的建议通过微量肉汤稀释法进行抗微生物药敏试验，并将使用 CLSI 断点 (3) 进行分类分配。 将包括以下药物：厄他培南、亚胺培南、美罗培南、头孢吡肟、头孢他啶、头孢噻肟、哌拉西林/他唑巴坦、阿莫西林/克拉维酸、环丙沙星、左氧氟沙星、庆大霉素、阿米卡星。

如前所述 (9, 15)，将使用 PCR 和测序通过分子分析研究 ESBL 决定簇的性质。 TEM-、SHV、CTX-M- 和 PER 型（i. e.那些已知在意大利流行的病毒 (9, 15)) 将受到调查。 如果可用探针的结果为阴性，将重新确认 ESBL 表型，如果为阳性，将通过以下方式研究 -内酰胺酶 deerminants 的性质：(i) 使用先前描述的粗提物进行分析等电聚焦 (IEF)方法（14）； (ii) DN​​A 微阵列技术，使用我们实验室开发的 β-内酰胺酶基因微阵列，其中包括针对不常见 ESBL 基因（如 VEB、GES、BES、SFO 和 TLA 酶）的探针。 如果通过上述方法未检测到新的 ESBL 基因（不太可能发生），如果产生 ESBL 但未被已知抗性决定因子的存在所解释，则将通过鸟枪法克隆方法研究抗性决定因子通过映射和排序。

同一物种分离株之间的克隆相关性将通过高通量基因分型技术进行研究，例如 RAPD（随机扩增多态性 DNA）和/或通过 AFLP（扩增片段长度多态性）分析和/或 REP PCR (19-21)。 在选定的分离株中，将通过脉冲场凝胶电泳 (PFGE) 对基因组 DNA 进行宏观限制性分析来进行克隆关系。

如果这些信息与临床和流行病学数据相关，将在选定的病例中考虑质粒分析和非 β-内酰胺药物耐药决定因素的调查（通过分子技术）。