Infecciones causadas por enterobacterias productoras de ESbL en Italia

PLAN Y METODOLOGÍA DE LA INVESTIGACIÓN

Población Todos los pacientes con infecciones (es decir, bacteriemia, neumonía, infecciones del abdomen, infecciones de la piel e infecciones del tracto urinario) causadas por Enterobacteriaceae productoras de BLEE.

Criterios de exclusión Niños < 16 años

Diseño del ensayo Estudio de cohorte prospectivo multicéntrico. Los pacientes correspondientes a la definición del estudio serán detectados mediante la inspección diaria de las bases de datos microbiológicas por parte de un médico dedicado. Las variables epidemiológicas se detectarán para todos los pacientes al ingreso al estudio. Identificar los factores de riesgo de infecciones (es decir, bacteriemia, neumonía, infecciones abdominales, infecciones de la piel e infecciones del tracto urinario) causadas por Enterobacteriaceae productoras de BLEE, se realizará un estudio de casos y controles. Un paciente caso se definirá como un paciente adulto (> 16 años de edad) que tiene una infección causada por enterobacterias productoras de BLEE según las definiciones del Centro para el Control y la Prevención de Enfermedades de Atlanta (CDC). En los Laboratorios de Microbiología Clínica, la definición de producción de BLEE por parte de los Laboratorios de Microbiología Clínica será de acuerdo con las guías CLSI (3), o con las guías BSAC (http://www.bsac.org.uk) para especies distintas a Klebsiella spp. ., E. coli y Proteus mirabilis. Se seleccionará un control para cada caso. El control se elegirá entre todos los pacientes adultos ingresados ​​en el mismo hospital durante el mismo período (dentro de los 30 días) y en los que no se hayan aislado Enterobacteriaceae productoras de BLEE durante su estancia hospitalaria. Si se dispondrá de más de un control por caso, se elegirán los pacientes con la fecha y hora de ingreso más próxima al caso.

Para identificar los factores de riesgo de mortalidad se realizará un segundo estudio de casos y controles comparando pacientes infectados que fallecieron con pacientes infectados que sobrevivieron (evaluable en pacientes con bacteriemia, infecciones de heridas, neumonía y meningitis, únicamente). Este análisis se realizará ajustando los resultados por terapia antimicrobiana empírica inadecuada y sitio de infección (ver definiciones a continuación).

Recopilación de datos Se revisarán los registros médicos de las admisiones de pacientes hospitalizados y las bases de datos de microbiología y farmacia. Los datos recopilados en el momento de la inscripción en el estudio incluirán: datos demográficos del paciente, traslado desde otro hospital, residente de un centro de larga duración o de un asilo de ancianos, hospitalización previa dentro de un año, estado ambulatorio, necesidad de hemodiálisis crónica, presencia de un catéter venoso central (CVC) y estancia en la UCI y procedimientos quirúrgicos en los 30 días anteriores a la inclusión en el estudio. Se derivará una puntuación compuesta de enfermedades comórbidas utilizando la puntuación de Charlson. La gravedad de la enfermedad en el momento de la presentación se cuantificará utilizando los criterios de McCabe y Jackson. Se registrarán los antibióticos administrados durante un período de 30 días antes de la inscripción en el estudio y durante al menos 48 horas. Para el análisis de factores de riesgo, la exposición a antibióticos orales e intravenosos se analizará por antibióticos individuales y por clases, e incluirá penicilinas, vancomicina, cefalosporinas, antibióticos con actividad predominantemente anaeróbica (metronidazol y clindamicina), aminoglucósidos, quinolonas y carbapenémicos. La duración de la estancia (LOS) después del diagnóstico de la infección, el manejo de las infecciones, el momento y el tipo de terapia antimicrobiana, los resultados de los cultivos clínicos de seguimiento (si los hay), las complicaciones hematógenas y la muerte también se extraerán de los registros médicos. También se revisarán los registros de microbiología para la recuperación de enterococos resistentes a la vancomicina (VRE) o S. aureus resistente a la meticilina (MRSA) en los 12 meses anteriores a la inscripción en el estudio. Todos los pacientes con infecciones causadas por Enterobacteriaceae productoras de BLEE serán seguidos hasta el alta hospitalaria o muerte.

La mortalidad se definirá como la muerte ocurrida durante la hospitalización del estudio. Se considerará terapia antimicrobiana adecuada el inicio de terapia con actividad frente a Enterobacteriaceae productoras de BLEE (según los resultados del patrón de susceptibilidad antimicrobiana del aislado) desde el día anterior hasta los 2 días posteriores al resultado positivo del cultivo clínico inicial.

Resultados Resultados primarios

1. Factores de riesgo para el desarrollo de infecciones causadas por bacterias productoras de BLEE;
2. Factores de riesgo para una terapia antimicrobiana inicial inadecuada;
3. Mortalidad general y mortalidad a los 30 días entre los pacientes que recibieron una terapia antimicrobiana inicial inadecuada (evaluable en pacientes con bacteriemia, infecciones abdominales y neumonía, únicamente);
4. Variabilidad por sitio de infección de la mortalidad global y la mortalidad a los 30 días entre los pacientes que reciben una terapia antimicrobiana inicial inadecuada (evaluable en pacientes con bacteriemia, infecciones abdominales y neumonía, únicamente).

Resultados secundarios

1. Duración de la hospitalización;
2. Costos de una terapia inicial inadecuada;
3. Días de defervescencia.

Análisis estadístico Al final del estudio se realizarán dos análisis diferentes: el primero considerará pacientes con bacteriemia, infecciones abdominales y neumonía, y se centrará en la mortalidad; el segundo análisis considerará a todos los pacientes infectados y se centrará en el análisis de los factores de riesgo y los resultados secundarios.

Justificación del tamaño de la muestra Supuestos

Pacientes con bacteriemia, neumonía, infecciones de abdomen, infecciones de piel e infecciones de vías urinarias (primer análisis):

Mortalidad entre pacientes con terapia inicial inadecuada: 25% Mortalidad entre pacientes con terapia inicial adecuada: 13%

Todos los pacientes incluidos:

Porcentaje de bacteriemia: 20% Porcentaje de neumonía: 10% Porcentaje de infecciones de abdomen: 15% Porcentaje de infecciones de piel: 3% Porcentaje de infecciones de vías urinarias: 52%

Resultados primarios Factores de riesgo de mortalidad Diferencia de mortalidad entre controles (tratamiento inapropiado) y casos (tratamiento apropiado): anticipamos una reducción del 25% al ​​13%.

Resultados secundarios Diferencia de la duración de la hospitalización entre los casos (tratamiento adecuado) y los controles (tratamiento inapropiado): anticipamos una disminución del 80 % (duración de la hospitalización < 15 días) al 40 %.

Diferencia de disminución de la fiebre entre casos (tratamiento adecuado) y controles (tratamiento inapropiado): anticipamos una disminución del 85 % (defervescencia < 3 días) al 30 %.

Asumiendo que p1=p2, donde p1 es la proporción en la población 1 y p2 es la proporción en la población 2 y que alpha=0.05 (bilateral), potencia=0,80.

Tamaño de muestra necesario para el análisis de factores de riesgo de mortalidad: 366 pacientes con bacteriemia, infección de heridas, neumonía y meningitis. Para incluir 366 pacientes con las infecciones notificadas anteriormente, es probable que el tamaño total de la muestra sea de 813 pacientes infectados con Enterobacteriaceae productoras de ESBL.

Análisis microbiológico de cepas bacterianas

Todos los aislamientos productores de BLEE obtenidos de los pacientes incluidos en el estudio en los Laboratorios de Microbiología Clínica de cada Centro Clínico serán recolectados y sujetos a una investigación adicional que incluye:

• confirmación de la identificación a nivel de especie;
• determinación del perfil de resistencia antimicrobiana frente a un conjunto estándar de medicamentos;
• análisis de los determinantes de BLEE;
• análisis de la relación clonal entre aislados bacterianos de la misma especie. Los resultados del análisis microbiológico se utilizarán para la correlación con los datos clínicos para evaluar el impacto epidemiológico y clínico de las cepas productoras de ESBL.

Metodología experimental

La confirmación de la identificación de los aislamientos bacterianos a nivel de especie se realizará mediante métodos fenotípicos estándar (10). En caso de ambigüedad en los resultados, la identificación se confirmará mediante secuenciación del ADNr 16S (16).

Las pruebas de susceptibilidad antimicrobiana se realizarán mediante microdilución en caldo según lo recomendado por el CLSI (3), y la asignación categórica se realizará utilizando los puntos de corte del CLSI (3). Se incluirán los siguientes agentes: ertapenem, imipenem, meropenem, cefepima, ceftazidima, cefotaxima, piperacilina/tazobactam, amoxicilina/clavulanato, ciprofloxacina, levofloxacina, gentamicina, amikacina.

La naturaleza de los determinantes de BLEE se investigará mediante análisis molecular mediante PCR y secuenciación, como se describió anteriormente (9, 15). La presencia de determinantes BLEE de tipo TEM-, SHV, CTX-M- y PER (i. mi. los que se sabe que circulan en Italia (9, 15)) serán investigados. En caso de resultados negativos con las sondas disponibles, se reconfirmará el fenotipo BLEE y, en caso positivo, se estudiará la naturaleza de los determinantes de las -lactamasas mediante: (i) isoelectroenfoque analítico (IEF) sobre extractos crudos utilizando métodos (14); (ii) tecnología de microarrays de ADN, utilizando un microarreglo para genes de β-lactamasa que se ha desarrollado en nuestro laboratorio, que incluye sondas para genes de BLEE poco comunes como las enzimas VEB, GES, BES, SFO y TLA. En el caso de nuevos genes ESBL no detectados por los métodos anteriores (algo poco probable), En el caso de producción de ESBL pero no explicada por la presencia de determinantes de resistencia conocidos, los determinantes de resistencia se estudiarán por medio de un enfoque de clonación de escopeta seguido por mapeo y secuenciación.

La relación clonal entre aislados de la misma especie se investigará mediante técnicas de genotipado de alto rendimiento como RAPD (ADN polimórfico amplificado al azar) y/o mediante análisis AFLP (polimorfismo de longitud de fragmento amplificado) y/o REP PCR (19-21). En aislados seleccionados, las relaciones clonales se realizarán mediante análisis de macrorestricción del ADN genómico mediante electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE).

El análisis de plásmidos y la investigación de determinantes de resistencia a agentes no β-lactámicos (mediante técnicas moleculares) se considerarán en casos seleccionados, en caso de que esta información sea relevante para la correlación con datos clínicos y epidemiológicos.